遺基礎(chǔ)與基因工程課件

1、遺傳基礎(chǔ)與基因工程 一、遺傳及其分子基礎(chǔ)1) DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù)2) 核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制3) 基因的概念與發(fā)展4) 遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控二、基因工程及其應(yīng)用1) 基因工程概述2) 基因工程的基本操作3) 基因工程的基本工具4) 基因工程的應(yīng)用本章主要內(nèi)容11、DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù)1.1 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)1.2 DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù) A) 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn) B) 噬菌體侵染試驗(yàn) C) 煙草花葉病毒重建試驗(yàn)1.3 非核酸類的遺傳物質(zhì)一、遺傳及其分子基礎(chǔ)2遺傳物質(zhì)應(yīng)具備的三種基本功能：1、復(fù)制功能：遺傳物質(zhì)必須貯存遺傳信息，并能將其復(fù)制且一代一代精確地傳遞

2、下去。 2、表達(dá)功能：遺傳物質(zhì)必須控制生物體性狀的發(fā)育和表達(dá)。3、變異功能：遺傳物質(zhì)必須發(fā)生變異，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，沒(méi)有變異就沒(méi)有進(jìn)化。DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù)31. 每個(gè)物種不同組織的細(xì)胞不論其大小和功能如何。它們的DNA在含量上是恒定的，而且配子中的DNA含量正好是體細(xì)胞的一半。2. DNA在代謝上是比較穩(wěn)定的。3. DNA是所有生物的染色體所共有。4. 不同波長(zhǎng)的紫外線誘發(fā)各種生物突變時(shí)，其最有效的波長(zhǎng)均為2600，這與DNA所吸收的紫外線光譜是一致的。1.1 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)4(1) 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn) (1928，英國(guó)Griffith/Avery)1.2 DNA是遺

3、傳物質(zhì)的直接證據(jù)5DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)(2)噬菌體侵染試驗(yàn)(1952，美國(guó)Hershey和Chase)6DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)(3)煙草花葉病毒重建試驗(yàn)(1956，美國(guó)Fraenkel-Conrat)7朊蛋白(病毒)：又稱蛋白質(zhì)侵染因子。朊病毒是一類能侵染動(dòng)物并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小分子的無(wú)免疫性疏水蛋白質(zhì)。1982年，美國(guó)Prusiner發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病是蛋白質(zhì)侵染引起的疾病，并稱為“Prion”即朊病毒。朊病毒具有蛋白質(zhì)的特性，又與“真病毒”有明顯差異。朊病毒對(duì)許多理化因子有強(qiáng)抵抗力，如甲醛、DNA酶、紫外線、射線和超聲波。在80不被破壞，但對(duì)苯酚、蛋白酶、尿素等敏感，對(duì)干擾素不敏感，

4、迄今尚無(wú)有效防治方法。致病機(jī)制： 1982年普魯辛納提出了朊病毒致病的“蛋白質(zhì)構(gòu)象致病假說(shuō)”，以后魏斯曼等人對(duì)其逐步完善。朊病毒的復(fù)制機(jī)理最引起當(dāng)今科學(xué)家興趣和關(guān)注。 1.3 非核酸類的遺傳物質(zhì)8一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)三、RNA的分子結(jié)構(gòu)四、DNA的生物合成2、核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制9DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)指DNA的組成單位核苷酸殘基在分子中的線性排列順序。由4種脫氧核糖核苷酸以3,5-磷酸二酯鍵連接起來(lái)的直線或環(huán)形多聚體。通常用堿基符號(hào)表示。一級(jí)結(jié)構(gòu)書(shū)寫(xiě)方法：從5 到3方向：一、 DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)10關(guān)于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結(jié)構(gòu)等是生物化學(xué)中討論的內(nèi)容。在此談三

5、個(gè)關(guān)于核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容： (一)“四核苷酸”假說(shuō)； (二) 查伽夫定則及其意義； (三) 核苷酸序列及其測(cè)定。核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)11Levene (1930)提出“四核苷酸”假說(shuō)，認(rèn)為：A）核苷酸是核酸的基本組成單位；B）核酸是“磷酸核糖(堿基)磷酸”的核苷多聚體。四核苷酸假說(shuō)奠定了核酸化學(xué)基礎(chǔ)。但同時(shí)認(rèn)為： 1）核酸多聚體是由“四核苷酸結(jié)構(gòu)”重復(fù)形成； 2）每個(gè)四核苷酸結(jié)構(gòu)包含四種堿基各一個(gè)； 所以認(rèn)為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)。這種觀念影響了人們對(duì)核酸生物學(xué)功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。(一) “四核苷酸”假說(shuō)12Chargaff于1946-1950年根據(jù)紙層析、離

6、子交換層析和紫外分光光度試驗(yàn)結(jié)果提出查伽夫定則： A）四種堿基的數(shù)量不是等量的； B）同一物種DNA堿基組成不變，物種間則有很大不同； C）嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。(二) 查伽夫定則及其意義13查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)，核酸的堿基序列信息可能具有重要意義。后來(lái)的研究表明：堿基序列正是核酸生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，是遺傳信息的內(nèi)在形式。DNA及RNA分子序列分析技術(shù)也是最重要的分子遺傳學(xué)研究技術(shù)：Sanger雙脫氧鏈終止法；Maxam-Gillbert化學(xué)修飾法；基于化學(xué)法的DNA序列自動(dòng)分析儀已成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。(三)

7、 核苷酸序列及其測(cè)定14(一) DNA分子結(jié)構(gòu)的研究在“四核苷酸結(jié)構(gòu)”理論的誤導(dǎo)下，人們普遍認(rèn)為核酸的組成、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可能不具有重要功能，一度忽略了對(duì)核酸的研究。上世紀(jì)中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然，DNA的結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)一步研究其功能和作用方式的基礎(chǔ)。也由此激發(fā)了科學(xué)家從事核酸結(jié)構(gòu)研究的興趣，當(dāng)時(shí)進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)研究的科學(xué)家很多，最重要有三個(gè)研究組：二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)15主要工作：鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質(zhì)-螺旋模型后)開(kāi)始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)阿斯伯利(Astbury)等1938年獲得的DNA晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。提

8、出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。評(píng)價(jià)：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。1. 鮑林研究小組16主要工作成就：Wilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術(shù)；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)位于外側(cè)，并測(cè)得了DNA螺旋的直徑和螺距。2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組17Waston/Crick(1951-1953)：研究手段非常簡(jiǎn)單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。理論知識(shí)深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用

9、。3. 沃生、克里克研究小組18主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個(gè)方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。現(xiàn)在人們公認(rèn)這是分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志。Waston/Crick和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。沃生、克里克研究小組191. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)(1)(二) DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型DNA分子是由兩條方向相反的平行多聚脫氧核糖核苷酸鏈構(gòu)成，它們圍繞一個(gè)中心軸形成右手雙螺旋。直徑為2.0nm，每環(huán)繞一周升高3.4nm（螺距），兩個(gè)相鄰的堿基對(duì)之間的軸向距離為0.34nm，方向相差36度

10、，因此平均每周含有10個(gè)堿基對(duì)（bp）。201. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)(2)(二) DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型磷酸-核糖通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵相連形成的親水骨架，位于雙螺旋的外側(cè)。疏水性的堿基處于內(nèi)側(cè)上下相鄰的堿基平面互相平行，且與中心軸垂直。核糖平面與中心軸平行。穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素主要是堿基堆積力。211. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)(3)(二) DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型DNA分子的兩條鏈通過(guò)有規(guī)律的嘌呤-嘧啶堿基配對(duì)相結(jié)合；A=T；G C；雙螺旋結(jié)構(gòu)并沒(méi)有限制堿基排列順序。221. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)(4)(二) DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型大溝（major groove）

11、小溝（minor groove）對(duì)于DNA與其特異結(jié)合蛋白之間的相互識(shí)別非常重要。1.2, 0.850.6, 0.7523DNA分子的X射線衍射圖譜24堿基配對(duì)及氫鍵形成25RNA的分子結(jié)構(gòu)在化學(xué)組成上也是由四種核苷酸組成的多聚體。它與DNA的不同在于以U代替了T，并用核糖代替脫氧核糖。此外還有一個(gè)重要的不同點(diǎn)，就是絕大部分RNA以單鏈形式存在，但可折疊起來(lái)形成若干雙鏈區(qū)域。在這些區(qū)域內(nèi)，互補(bǔ)的堿基對(duì)間可以形成氫鍵。但有一些以RNA為遺傳物質(zhì)的動(dòng)物病毒含有雙鏈RNA。三、RNA的分子結(jié)構(gòu)一個(gè)RNA的分子結(jié)構(gòu)26絕大多數(shù)DNA或RNA的生物合成，均按照Watson-Crick的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，

12、以拷貝預(yù)先存在的DNA鏈（模板鏈）的方式進(jìn)行。核酸鏈合成的方向只有一個(gè)：53。特異的聚合酶催化合成DNA或RNA。四、DNA的生物合成27一、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念二、生化遺傳和早期分子遺傳學(xué) 對(duì)基因概念的發(fā)展三、現(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念3、基因的概念與發(fā)展28經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為基因是一個(gè)最小的單位，不能分割，既是結(jié)構(gòu)單位，又是功能單位?；蚓哂邢铝泄残裕?)基因具有染色體的重要特征(即基因位于染色體上)，能自我復(fù)制，相對(duì)穩(wěn)定，在有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)，有規(guī)律地進(jìn)行分配；2)基因在染色體上占有一定的位置（即位點(diǎn)），并且是交換的最小單位，即在重組時(shí)不能再分割的單位：3)基因是以一個(gè)整體進(jìn)行突變的，故

13、它是一個(gè)突變單位；4)基因是一個(gè)功能單位，它控制正在發(fā)育有機(jī)體的某一個(gè)或某些性狀。一、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念29分子遺傳學(xué)的發(fā)展揭示了遺傳密碼的秘密，使基因的概念落實(shí)到具體的物質(zhì)上，即基因在DNA分子上，一個(gè)基因相當(dāng)于DNA分子上的一定區(qū)段，它攜帶有特定的遺傳信息。這類遺傳信息或被轉(zhuǎn)錄為RNA，包括信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA；或者信使RNA被翻譯成多肽鏈。另一方面，在精細(xì)的微生物遺傳分析中查明，基因并不是不可分割的最小單位，而是遠(yuǎn)為復(fù)雜得多的遺傳和變異的單位。 二、生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)對(duì)基因概念的發(fā)展30隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)的發(fā)展，在分子水平上，根據(jù)重組、突變和功能將基因分成3個(gè)單位：

14、 1）突變子：就是指性狀突變時(shí)產(chǎn)生突變的最小單位。一個(gè)突變子可以小到只有一個(gè)堿基對(duì)； 2）重組子：就是指性狀重組時(shí)，可交換的最小單位。一個(gè)交換子可以只包含一個(gè)堿基對(duì)； 3）順?lè)醋樱罕硎疽粋€(gè)起作用的單位，基本符合通常所述的基因的大小或略小。一段DNA與一個(gè)多肽鏈合成相對(duì)應(yīng)，平均為500-1500個(gè)堿基對(duì)。 三、現(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念(一)、現(xiàn)代基因概念31順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)進(jìn)一步把基因具體化為DNA分子上特定的一段順序順?lè)醋?，基因是一段有功能的DNA序列，是一個(gè)遺傳功能單位，其內(nèi)部又是可分的，包含多個(gè)突變子和重組子。也就是說(shuō)，基因包含許多突變子和重組子，可以包含多個(gè)功能單位(順?lè)醋?。經(jīng)典遺傳學(xué)作為

15、結(jié)構(gòu)單位的基因，實(shí)際上包含大量的突變子或重組子，因此其認(rèn)為基因是最小的結(jié)構(gòu)單位的觀念已經(jīng)不能成立了，然而關(guān)于基因是一個(gè)功能單位的概念仍然是正確的?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念32根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為：1. 編碼蛋白質(zhì)的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)基因。2. 沒(méi)有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。3. 不轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段。 如啟動(dòng)基因、操縱基因。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA多聚酶與DNA結(jié)合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結(jié)合的部位?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念(二)、 基因的功能類型331. 重

16、復(fù)基因：指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。最典型的重復(fù)基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。2. 重疊基因：同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉(zhuǎn)錄范圍)不同，同時(shí)成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個(gè)基因完全存在于另一個(gè)基因內(nèi)部?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念(三)、基因的幾種特殊形式343. 斷裂基因或隔裂基因：生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)，但1977年Doel研究表明，卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段；內(nèi)

17、含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段。真核生物基因可能是不同外顯子的組合斷裂基因?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念354. 跳躍基因：又稱為轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子(transposable element)。生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)認(rèn)為基因在染色體上的相對(duì)位置是固定的。后來(lái)發(fā)現(xiàn)某些DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位的過(guò)程也是一個(gè)遺傳重組過(guò)程；轉(zhuǎn)座子在染色體上的轉(zhuǎn)位可能會(huì)引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉(zhuǎn)位離開(kāi)插入點(diǎn)時(shí)便會(huì)發(fā)生基因功能的恢復(fù)?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)中基因的概念36中心法則：遺傳信息從DNADNA的復(fù)制，以及遺傳信息從DNAmRNA蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程，這就是分子生物學(xué)的中

18、心法則(central dogma) 中心法則闡述生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過(guò)程中的信息流向。最初由Crick提出，并經(jīng)過(guò)了多次修正。4、遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控37中心法則闡述的是基因的兩個(gè)基本屬性：復(fù)制與表達(dá)。關(guān)于這兩個(gè)屬性的分子水平的分析，對(duì)深入理解遺傳及變異的實(shí)質(zhì)具有重要的意義。這一法則被認(rèn)為是從噬菌體到真核生物的整個(gè)生物界共同遵循的規(guī)律。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)RNA可以反轉(zhuǎn)錄成為DNA，RNA還可以自我復(fù)制以及在離體條件下DNA可以直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而增加了原中心法則的信息流向，豐富了中心法則的內(nèi)容。中心法則及其發(fā)展38中心法則及

19、其發(fā)展反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)：反轉(zhuǎn)錄酶；cDNA。RNA的自我復(fù)制。DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。39基因表達(dá)：基因攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變成可辨別的表型的整個(gè)過(guò)程?；虮磉_(dá)主要包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。（mRNA、tRNA、rRNA）翻譯：是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)子遺傳密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯40第二部分：基因工程及其應(yīng)用一、基因工程概述二、基因工程的基本操作三、基因工程的基本工具四、基因工程的應(yīng)用41基因工程：通過(guò)體外重組將外源基因?qū)胧荏w

20、細(xì)胞，使該基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作叫做基因工程?；蚬こ虒?shí)施的四個(gè)必要條件：工具酶，目的基因，載體，受體細(xì)胞?；蚬こ痰膬蓚€(gè)基本特點(diǎn)：1.分子水平的操作；2. 細(xì)胞水平的表達(dá)。一、基因工程概述421.目的基因的獲取2.載體的選擇3.目的基因與載體DNA的體外重組4.重組載體引入受體細(xì)胞5.重組體的篩選和鑒定二、基因工程的操作技術(shù)431. 內(nèi)切酶法2. 機(jī)械力降解3. 化學(xué)合成4. 通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)分離目的基因5. 通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)分離目的基因6. PCR制備法1. 目的基因的獲取441. 限制性內(nèi)切酶法(鳥(niǎo)槍法或散彈法)：用酶降解染色體DNA(esp原核生物)，將降解的D

21、NA克隆到載體上，從而得到目的基因。優(yōu)點(diǎn)：原理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，具有一定的應(yīng)用范圍。缺點(diǎn)：隨機(jī)性有限，盲目性大，篩選麻煩，應(yīng)用范圍有限(只適用于原核生物)目的基因的獲取452、機(jī)械降解法：用超聲波震蕩等機(jī)械法使DNA斷裂。優(yōu)點(diǎn)：隨機(jī)性大缺點(diǎn)：所得基因片段不能直接連接，需加工修飾。3. 通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)：cDNA文庫(kù)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌克隆子群體中，這樣的群體稱為cDNA文庫(kù)。目的基因的獲取463、化學(xué)合成法a.acodeDNA化學(xué)合成4.PCR（polymerase chain reaction）5. 通過(guò)構(gòu)建基

22、因文庫(kù)基因文庫(kù)(genomic library)：因限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一段與一個(gè)載體連接成重組DNA，并引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，稱基因文庫(kù)。目的基因的獲取47是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子(replicon)；能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，即有較高的復(fù)制率；載體上有限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；載體上必須有一種遺傳標(biāo)記，以便及時(shí)把極少數(shù)“工程菌”或“工程細(xì)胞”選擇出來(lái)。原核受體細(xì)胞載體主要有細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體兩類。動(dòng)物細(xì)胞載體主要有SV40病毒。植物細(xì)胞則主要是Ti質(zhì)粒。2. 載體的選擇481) 粘性末端連接：限制性核酸內(nèi)

23、切酶處理可使參加重組的兩個(gè)DNA分子產(chǎn)生“榫頭”和“卯眼”似的互補(bǔ)粘性末端。然后低溫下“退火”。由于每一種限制性核酸內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA的粘性末端有相同的核苷酸組分，所以當(dāng)兩者相混時(shí)，凡粘性末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈。在連接酶的作用下，供體的目的基因就與載體的DNA片段接合，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組載體嵌合體(chimaera)。載體經(jīng)酶切后，易自身環(huán)化，形成自身載體。處理方法之一：堿性磷酸酶處理5-P。3. 目的基因與載體DNA的體外重組49目的基因與載體DNA的體外重組2) 利用人工接頭(linker)連接：帶有限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的一段人工D

24、NA片段。503)同聚物加尾法連接目的基因與載體DNA的體外重組4)平端連接：不同的限制性內(nèi)切酶切割后的粘性末端，用適當(dāng)?shù)拿笇NA突出的末端削平或補(bǔ)齊成平末端；平末端連接效率低；所用ATP及T4連接酶的濃度比，粘性末端連接要高些(大于2.5倍)。51 要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？思考與討論基因A52受體細(xì)胞的選擇原則1) 便于重組DNA分子的導(dǎo)入和篩選克隆子。2) 重組DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定維持。3) 適于外源基因的高效表達(dá)、分泌或積累；對(duì)于真核目的基因，應(yīng)具有較好的翻譯后加工機(jī)制。4) 對(duì)遺傳密碼的應(yīng)用上無(wú)明顯偏倚性。5) 易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)

25、酵生長(zhǎng)，具有較高應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值。6) 安全性高，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染4. 重組載體引入受體細(xì)胞53(一) 原核生物細(xì)胞：如大腸桿菌、枯草桿菌、棒狀桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。特點(diǎn)： 1) 大部分無(wú)堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，便于外源DNA導(dǎo)入； 2) 基因組小，遺傳背景簡(jiǎn)單； 3) 多數(shù)為單細(xì)胞生物，易獲得一致性實(shí)驗(yàn)材料； 4) 培養(yǎng)簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。常用受體細(xì)胞54(二) 真核生物細(xì)胞：特點(diǎn)：具備真核基因表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物加工的機(jī)制 1) 酵母單細(xì)胞真菌；基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；培養(yǎng)簡(jiǎn)單；外源基因表達(dá)產(chǎn)物能被分泌至培養(yǎng)基中；安全 2) 植物細(xì)胞全能性；有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁 3) 動(dòng)物細(xì)胞常用受

26、體細(xì)胞551) 轉(zhuǎn)化2) 轉(zhuǎn)染3) 感染4) 其它方法重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法56轉(zhuǎn)化：由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)胞：指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)，可以通過(guò)物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入的外源DNA的切割，用符號(hào)R-M-表示。限制修飾系統(tǒng)缺陷變異株：即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。1) 轉(zhuǎn)化57重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體介導(dǎo)法電穿孔法：高壓電脈

27、沖DEAE-葡聚糖法(內(nèi)吞作用)顯微注射法2) 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體58噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖即感染。經(jīng)人工改造的噬菌體活病毒作載體與目的序列重組在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞感染效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較復(fù)雜。3) 感染59基因槍轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔法超聲波處理法體內(nèi)注射法精子介導(dǎo)法低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法4) 其它方法605. 重組體的篩選和鑒定1) 遺傳學(xué)方法2) 免疫學(xué)方法3) 核酸雜交法4) PCR技術(shù)5) 酶切鑒定61遺傳學(xué)方法-根據(jù)標(biāo)記基因篩選A)根據(jù)抗生素抗性基因篩選：含抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

28、后，細(xì)菌在含這種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌即被殺死，能生長(zhǎng)的就是成功轉(zhuǎn)化的；對(duì)于帶有抗生素抗性基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。 例：四環(huán)素抗性基因tcr或tetr；卡那霉素抗性基因knr或kanr；鏈霉素抗性基因smr或strr；氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶基因cat或cmrB)根據(jù)報(bào)告基因篩選：熒光蛋白基因；螢火蟲(chóng)熒光素酶基因；-葡萄糖酸苷酶基因。重組體的篩選和鑒定62抗生素抗性標(biāo)記基因篩選原理63C)根據(jù)標(biāo)志互補(bǔ)進(jìn)行篩選：1) 轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體株菌的突變?nèi)毕菪?受體菌his- 外源基因his+2) -互補(bǔ)：當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框

29、架改變，LacZ(-半乳糖苷酶)基因表達(dá)蛋白失活，產(chǎn)生的氨基酸片段失去-互補(bǔ)能力，含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。而沒(méi)有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生-互補(bǔ)，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。(藍(lán)白篩選)在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)重組體的篩選和鑒定641. 基因工程的工具酶2. 基因工程的載體三、基因工程的基本工具65一、限制酶(restriction enzyme)：限制性內(nèi)切酶酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)：通常4-6bp，具有回文結(jié)構(gòu)(palindrom)。1. 基因工程的工具酶1) 產(chǎn)生粘性末端(s

30、ticking end) 5-末端: EcoR 1: 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-末端: Pst1 : 5-CTGCAG-3 3 -GACGTC-52) 產(chǎn)生平末端(blunt end): Sma1: 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-566同功異源酶(isochizomers)：來(lái)源不同，識(shí)別和切割位點(diǎn)相同。 如：BamH 1 和 Bst 1同尾酶(isoaudamers)：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。 如：BamH 1 ： GGATCC Sau3A 1： NGATCN基因工程的工具酶67二、修飾酶：對(duì)DNA 或RNA 末端進(jìn)行剪切、補(bǔ)平、連接及化學(xué)修飾的酶

31、。1、DNA聚合酶 大腸桿菌中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)，MW 109KD 還具有53及35外切酶活性2、逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase)：以RNA為模 板合成DNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)3、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)：將3-OH 與5-P 連接形成3, 5-磷酸二酯鍵基因工程的工具酶684、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）：去除DNA or RNA 5-P，制備載體時(shí)可防止載體自身連接， 提高重組效率。5、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 末端轉(zhuǎn)移酶 作用：在DNA的3-OH上，加上 dNTP6、Taq DNA聚合酶 和其它耐熱DNA聚合酶 PCR時(shí)基因工程的工具酶69內(nèi)切酶、堿性磷酸酶、連接酶的作用70本質(zhì)：DNA，攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。分類： 2. 載體 質(zhì)粒 入噬菌體 粘性質(zhì)粒 M13噬菌體 表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體克隆載體 按表達(dá)與否71大腸桿菌質(zhì)粒載體 PBR322枯草桿菌質(zhì)粒載體 PNC3酵母菌