微生物檢驗技術(shù)及硬件選擇課件

1、微生物檢驗技術(shù)及硬件選擇中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC姚粟 博士內(nèi)容微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)微生物檢驗技術(shù)及硬件設備微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)純培養(yǎng)物是指來源于同一單細胞的細胞群體。獲得純培養(yǎng)物對微生物學研究至關(guān)重要。微生物純培養(yǎng)分離技術(shù)涂布平板法平板劃線法平板傾注法稀釋搖管法液體培養(yǎng)基分離法單細胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)基分離法涂布平板法1、少量樣品加到平板中央（1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻；4、無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培養(yǎng)基表面，適當條件下培養(yǎng)。平板劃線法斜線法曲線法方格法放射法四格法平板劃線法斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平

2、板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿70角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。平板劃線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌（大的金黃色菌落）在劃線過程中，細胞逐漸分散，培養(yǎng)后可形成單個菌落。成功獲得純培養(yǎng)物依賴于樣品中混合在一起的細胞是否有效的被相互分開。平板傾注法對起始樣品進行連續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿后混合均勻，培養(yǎng)后獲得單菌落。培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而培養(yǎng)基內(nèi)部菌落呈豆狀或透鏡

3、狀。稀釋搖管法適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離無菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50左右 梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中 搖勻、冷凝在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物 培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間 液體培養(yǎng)基分離不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應超過95%）表現(xiàn)為不生長。 單細胞（孢子）分離單細胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體。個體相對較小的微生物，需采用顯

4、微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養(yǎng) 。 單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求。選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基特性促生長能力抑制能力指示（鑒別）能力選擇培養(yǎng)基分離傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基血平板：適于各類細菌的生長，一般細菌檢驗標本的分離，都應接種此平板。營養(yǎng)肉湯：用于標本及各類細菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標本。中國藍平板或伊紅美藍平板：可抑制G+細菌，有選擇地促進G-菌生長，是較好的弱選擇性培養(yǎng)基。麥康凱平板：具中等強度選擇性，抑菌力略強，有較少革蘭陰性菌不生長。SS瓊脂：有較強的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。

5、堿性瓊脂：用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。選擇培養(yǎng)基分離新型顯色培養(yǎng)基利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理來檢測微生物的培養(yǎng)基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlue Escherichia coli-galactosidase -Glucuronidase MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue微生物菌種檢驗技術(shù)采用多相鑒定技術(shù)確定菌株的分類地位采用菌株分型技術(shù)進行污染菌溯源分析微生物菌種檢驗技術(shù)分類等級

6、界（Domain）門（Phylum）綱（Class）目（Order）科（Family）屬（Genus）種（Species）三界系統(tǒng)細菌真核生物古菌“種”：微生物基本分類單元微生物菌種檢驗技術(shù)“種” 的定義：一個種（基因型種）是有相似G+C組成并通過DNA雜交試驗判斷有70%或更大相似性的菌株的集合。種的鑒定：確定新的分離物屬于已知分類單元“種”的過程。微生物菌種檢驗技術(shù)微生物菌種檢驗微生物菌種鑒定目標菌檢驗：它是不是某一種菌?菌種鑒定:它是什么菌？（未知菌）控制菌：大腸埃希菌（ Escherichia coli）大腸菌群（Coliform）沙門菌（Salmonella）銅綠假單胞菌（Pseud

7、omonas aeruginosa）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）梭菌（Clostridium）白假絲酵母（Candida albicans）致病菌：大腸埃希菌（ Escherichia coli）大腸菌群（Coliform）沙門菌（Salmonella）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）阪岐腸桿菌（Enterobacter sakazaki）致賀氏菌（ Shigella ）副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）空腸彎曲菌（Campylobact

8、er jejuni）產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ）規(guī)范的檢測鑒定方法中國藥典GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40常規(guī)鑒定、多相鑒定常規(guī)鑒定掌握菌株的基本特征，如細胞的形狀、革蘭氏染色及其他形態(tài)學特征；營養(yǎng)類型、需氧性等生理生化特征。在此基礎(chǔ)上根據(jù)分類（鑒定）手冊，確定菌株屬于哪一大類（群、組），進行特征測定。根據(jù)測定結(jié)果逐步縮小菌株的歸屬范圍，初步確定科、屬。進一步測定種的鑒別特征。如鑒定結(jié)果涉及新的分類單元，則進行包括基因型在內(nèi)的全面鑒定。用于鑒定的形態(tài)學特征特征微生物類群細胞

9、形狀所有主要類群細胞大小所有主要類群菌落形態(tài)所有主要類群超微結(jié)構(gòu)特征所有主要類群染色行為細菌、一些真菌纖毛和鞭毛所有主要類群運動機制滑行細菌，螺旋體內(nèi)生孢子形狀和位置形成內(nèi)生孢子細菌孢子形態(tài)和位置細菌、藻類、真菌細胞內(nèi)含物所有主要類群顏色所有主要類群用于鑒定的生理生化特征碳源和氮源運動性細胞壁組成滲透耐性能源氧關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物最適pH和生長范圍一般營養(yǎng)類型光合作用色素最適生長溫度和范圍鹽需求及耐性發(fā)光次級代謝產(chǎn)物形成能量轉(zhuǎn)換機制對代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內(nèi)含物基因型鑒定技術(shù)G+Cmol% 16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, -tub

10、ulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene and other housekeeping genes.DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) DNA-DNA hybridizationRAPD, RFLP, AFLP, SSCP, DGGE, LAMP, rep PCR.基因型分析鑒定水平不同指紋圖譜和DNA分析技術(shù)的鑒定水平多相鑒定技術(shù)Polyphasic Identification Technology微生物菌種鑒定技術(shù)表征（表

11、型）特征形態(tài)特征生理和代謝特征生態(tài)特征遺傳（基因型）特征蛋白質(zhì)比較核酸堿基組成核酸序列 Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, GermanyCMCC(F)98003 標準菌株CMCC(F)98003保藏于中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心。2005年開始,CMCC(F)98003作為絲狀真菌的代表菌株被中國藥典(第8版)指定為標準菌株。多相鑒定實例 CMCC(F)98003 形態(tài)學鑒定CYA培養(yǎng)基, 25C培養(yǎng)7 dBiolog鑒定生長濁度試驗ITS rDNA區(qū)序列分析ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5: 5-GGAAGTAA

12、AAGTCGTAACAAGG-3-微管蛋白基因序列分析Bt2a: 5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b: 5-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3反應體系：100 L, 10 擴增緩沖液10 L; DNA模板1 L ; dNTP (每種2.5 mmol/L) 8 L; 引物(10 L/L)各2.5 L; Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L; 無菌超純水補足總體積100 L。反應程序：94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30個循環(huán); 72C 10 min, 4C保存。多相鑒定實例 C

13、MCC(F)98003 形態(tài)學鑒定圖 25C培養(yǎng)7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài)Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 d注: A菌落形態(tài); B: 分生孢子梗形態(tài)( 100); C: 分生孢子形態(tài)( 400).Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).該菌株的形態(tài)學特征符合黑曲霉A. niger的形態(tài)特征多相鑒定實例 CMCC(F)98003 Biolog鑒定注: : 沒有生長; +: 生長旺盛

14、; w: 微弱(邊界)生長; v: 可變.Note: : No growth; +: Strong growth; w: Weak growth; v: Varied growth.表 碳源利用情況Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC16888Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麥芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Trehalose+L-蘋果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-

15、Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+多相鑒定實例 CMCC(F)98003 ITS rDNA區(qū)序列分析圖 CMCC(F)98003的ITS rDNA區(qū)序列和-微管蛋白基因序列PCR擴增結(jié)果Fig ITS rDNA and -tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003注: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA區(qū)PCR擴增結(jié)果; 2:-微管蛋白基因PCR擴增結(jié)果.Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR ampli

16、fication result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.表 ITS序列特殊位點堿基差異Table Difference of base position in ITS sequence堿基位點Base position140166172173Aspergillus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注: 以18S和ITS1區(qū)之間的TTACCG序列中的第一個“C”為1位點.Note: The first C in the

17、 border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1.多相鑒定實例 CMCC(F)98003 ITS rDNA區(qū)序列分析圖 基于ITS區(qū)rDNA序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注: 圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值, 圖例為遺傳距離.Note: Numbers above branches are boot

18、strap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003與與A. niger ATCC 16888聚類在分類距離最近的一個分支上, 序列相似性達100% 。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性也具有很高的相似性, 序列同源性均在98.6%100%之間。多相鑒定實例 CMCC(F)98003-微管蛋白基因序列分析圖 基于-微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence

19、 data of Aspergillus section Nigri注: 圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap 值大于50%數(shù)值, 圖例為遺傳距離.Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003與黑曲霉A. niger CBS554.65T序列同源性為100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在94.7%以下。多相鑒定實例 CMCC(F)98003結(jié)合形態(tài)學、碳源利用情況和IT

20、S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果, 將CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger ）。多相鑒定實例 CMCC(F)98003微生物菌種鑒定新技術(shù)及設備微生物快速鑒定技術(shù)MLSAPCR-SSCPPCR-DGGEPFGEFT-IRREAL-TIME PCRLAMP菌株快速鑒定系統(tǒng)BIOLOG Automatic Identification SystemVITEKVIDAS DiversiLabRiboprinter ABI-(MicroSeq)MLSA (Multilocus Sequences Analysis)MLST技術(shù)通過測序技術(shù)揭示看家基因的等

21、位基因突變來對菌株進行分型和鑒定。看家基因(housekeeping gene)幾乎都存在保守性，但不同的種或菌株間又存在差異即變異性。關(guān)鍵點:菌種的選擇、基因位點的選擇、特異引物的設計。PCR-SSCPPCR-SSCP(Polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism)是聚合酶鏈式反應與單鏈DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)相結(jié)合的一種用于檢測基因突變的方法。利用不同構(gòu)象單鏈DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異, 能快速有效地檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變。PCR-SSCP已廣泛應用于各

22、種基因多態(tài)性的研究。PCR-DGGE變性梯度凝膠電泳（DGGE） 是根據(jù)DNA片段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng)，在堿基序列存在差異的DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，一旦解鏈，在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳行為將發(fā)生很大的變化。將PCR得到的等長DNA片段在含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，染色后在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶，每個條帶代表一個特定序列的DNA片段。PCR-DGGEPFGEPFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)脈沖場凝膠電泳應用于分離純化大小在10-2000kb之間的DNA

23、片段。電泳在兩個不同方向的電場周期性交替進行，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間依賴于分子大小，DNA越大，構(gòu)象改變需要時間越長，在凝膠移動中越慢。大小不同的DNA片段被分離。FT-IR應用傅里葉變換紅外光譜方法（FT-IR）結(jié)合多變量統(tǒng)計分析的手段，可以實現(xiàn)對菌種進行分類和鑒別。核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等細胞大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成信息可以反映在紅外光譜圖上。細菌細胞的生化物質(zhì)的某些功能基團的差異可以成為區(qū)分和鑒定不同菌株的基礎(chǔ)。在菌種(species)甚至菌株(strain)水平上提供鑒別結(jié)果 。FT-IR路春霞、劉源、孫曉紅等，應用傅里葉變換紅外光譜區(qū)分鑒定四種食源性

24、致病菌的研究，化學學報，2011年第69卷，第1期，101-105REAL-TIME PCRReal-time PCR實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。LAMPLAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)核酸環(huán)介導等溫擴增技術(shù)主要是針對靶基因的6個不同的區(qū)域，設計4種引物。在恒定溫度下（65C）進行擴增反應。操作簡單、快速高效、高特異性和高靈敏度。BIOLOG 鑒定系統(tǒng)MicrostationOmnilogVITEK生化鑒定系統(tǒng)VITEK對細

25、菌的鑒定是以每種細菌的微量生化反應為基礎(chǔ)，不同種類的VITEK試卡（檢測卡）含有多種的生化反應孔。目前VITEK系統(tǒng)的檢測卡微生物常用的有7種，即：革蘭氏陽性菌鑒定卡（GPI）、革蘭氏陰性菌卡（GNI+）、非發(fā)酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厭氧菌卡（ANI）、芽胞桿菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血桿菌卡（NHI），以及藥敏檢測卡等?？设b定405種細菌。 VIDAS病原菌鑒定系統(tǒng)應用酶聯(lián)免疫法，檢測測藍色熒光（ELFA）抗原（細菌、蛋白）的含量與標本中抗原的含量成正比。測試范圍：沙門氏菌、李斯特菌、單核細胞增生李斯特菌、葡萄球菌腸毒素、大腸埃希菌O157、彎曲菌、免疫濃縮沙門氏菌、免疫濃縮大腸埃希菌O157。基于Rep-PCR重復序列聚合酶擴增反應genome1. rep-PCR引物與許多分布在整個基因組上的、特異性的重復序列配對rep-PCR primers2. 經(jīng)過PCR擴增形成多個不同長短的片段3. 這些擴增的片段根據(jù)其質(zhì)量差異，經(jīng)電泳被分離(+)(-)4. 得到由多條帶組成的、強弱不一的、專一性rep-PCR DNA指紋圖譜 Size of amplified fragments (time)DiversiLab菌株分型鑒定系統(tǒng)DiversiLab特定指紋圖譜的形成A