孕前遺傳學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)室基本流程及臨床意義

1、孕前遺傳學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)室基本流程及臨床意義 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)圍繞人外周血染色體制備、SCE觀察分析、性狀調(diào)查及皮紋分析等方面的工作，在掌握基本的實(shí)驗(yàn)方法及技能同時(shí)引導(dǎo)學(xué)生制定實(shí)驗(yàn)路線。在實(shí)驗(yàn)中有意識地培養(yǎng)同學(xué)們規(guī)范操作、仔細(xì)觀察和收集數(shù)據(jù)、科學(xué)的歸納分析等嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)事求是的科學(xué)素養(yǎng)。人外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)結(jié)果分析作業(yè)及思考題了解人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法。熟悉人類染色體的基本形態(tài)特點(diǎn)。掌握染色體標(biāo)本的制備方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理 外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素（phy

2、tohemagglutinin, PHA）時(shí)，這種小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并開始進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理、低滲、固定、滴片和染色，就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對染色體進(jìn)行觀察。這種培養(yǎng)方法是Moorhead于1960年建立的。在人類遺傳分析中普遍采用外周血培養(yǎng)的方法獲取分裂的細(xì)胞，進(jìn)而開展臨床和基礎(chǔ)遺傳學(xué)的研究。這對于遺傳疾病的檢出以及遺傳咨詢等工作發(fā)揮了重要作用。 抽濾器、恒溫水浴箱、離心機(jī)培養(yǎng)瓶、注射器、移液管、量筒RPMI1640、小牛血清、NaHCO3、生理鹽水、肝素、1.0g/L秋水仙素溶液、低滲液（0.025M KCl）、固定液三

3、、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 1. 植物血凝素 (PHA ) 刺激外周血淋巴細(xì)胞從G0期返回正常細(xì)胞周期。2. 秋水仙素 阻止微管組裝。 中期染色體無法排列赤道板。 抑制姐妹染色體的分離，將細(xì)胞停留在中期。 目的 : 獲得大量的中期細(xì)胞。 3. 固定劑 新配置的甲醇 & 冰醋酸混合液 (3:1)。4. 染料 Giemsa。四、實(shí)驗(yàn)步驟 培養(yǎng)液4ml小牛血清1ml全血培養(yǎng)72小時(shí)每ml培養(yǎng)液加1ug繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)培養(yǎng)秋水仙素培養(yǎng)瓶取樣 取1ml培養(yǎng)液于10ml離心管1.1000rpm離心5分鐘棄上清離心2.加KCl 5ml混勻37處理20分鐘低滲3.離心（同前）制片預(yù)冷冰片距離20cm以上玻片傾斜30迅

4、速吹氣過火焰3-5次7.8.9.空 氣干燥Giemsa染色10min細(xì)水流沖洗染色10.11.12.吹干鏡檢13.14.1) 離心機(jī)平衡： 離心管的重量平衡； 離心管偶數(shù)、對稱放置2) 細(xì)心、溫柔混勻沉淀；3) 冰、濕玻片；4) 確定將材料滴在玻片上；5) 不能烘烤!五、注意事項(xiàng) 六、結(jié)果分析 人中期細(xì)胞染色體（2N=46） 七、作業(yè)及思考題1. 觀察人類染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2. 總結(jié)做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。核型分析及SCE觀察實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)作業(yè)與討論 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖旧w組型分析的各種數(shù)據(jù)指標(biāo)學(xué)習(xí)染色體組型分析的基本方法掌握SCE（姐妹染色單體互換）形成的

5、原理和方法熟悉SCE計(jì)數(shù)方法并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性測驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)原理定義：染色體組型又稱核型，是指將動物、植物、真菌等的某一個體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細(xì)胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。核型模式圖是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。在DNA復(fù)制過程中，加入外源的5-溴脫氧尿苷(BrdU)使DNA雙鏈的化學(xué)組成形成差別，經(jīng)過分化染色處理，導(dǎo)致2條姐妹染色單體呈現(xiàn)深淺不同的色差。染色體的特征數(shù)目 （2n=46）長度（絕對長度、相對長度）著絲粒位置 （MSMSTT）隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置帶型分析應(yīng)用意義染色體

6、組型分析染色體水平上的表型識別單條染色體、基因定位臨床應(yīng)用（染色體疾病、產(chǎn)前診斷）人類23對染色體三、試驗(yàn)材料毫米尺、剪刀、膠水、計(jì)算器、白紙人染色體放大照片組型分析實(shí)驗(yàn)方法染色體數(shù)目確定染色體形態(tài)特征： 長度：絕對、相對 相對長度=每條染色體的長度/全套染色體長度 臂比=長臂/短臂 著絲點(diǎn)指數(shù)=短臂/（長+短臂） 隨體的有無分組排隊(duì)原則1. 著絲粒類型相同，相對長度相近的分一組；2. 同一組的按染色體長短順序配對排列；3. 各指數(shù)相同的染色體配為一對；4. 可根據(jù)隨體的有無進(jìn)行配對；5. 將染色體按長短排隊(duì)，短臂向上。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 計(jì)數(shù)，沿邊緣剪下染色體，編號；2. 初步目測配對，分組；

7、3. 測量長度，計(jì)算相對長度、著絲粒指數(shù)、臂比，相同的染色體間配對；4. 將配對好的染色體排列并粘貼在紙上，每一組下面畫一橫線，在兩端注明起止號，并在橫線下的中部寫明A-G組號，染色體從大到小編為1-22號，性染色體單獨(dú)列為一組。五、注意事項(xiàng)觀察細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為：1. 細(xì)胞形態(tài)完整、輪廓清晰。2. 染色體形態(tài)和分散良好。3. 在所觀察的細(xì)胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計(jì)數(shù)。4. 油鏡使用完后要及時(shí)清潔鏡頭。結(jié)果分析作業(yè)與討論1. 制作核型分析板作出書面報(bào)告。2. 統(tǒng)計(jì)分析SCE交換率。 人類某些遺傳性狀調(diào)查實(shí)驗(yàn)三 人類單基因遺傳的性狀或疾病在上下代之間的傳遞遵循孟德爾定律，在一個

8、大的群體中，通過調(diào)查分析這些性狀，可以對該群體的某一基因頻率及基因型頻率做出估計(jì)；另外某些性狀在臨床診斷上可以做為遺傳病的診斷參考。 較為常見的單基因遺傳性狀有：苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）嘗味、ABO血型、眼瞼的單與雙、耳垂的有或無、能卷舌和不能卷舌及額前發(fā)際的形狀等，均屬于單基因控制的性狀。一、PTC嘗味實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（1）了解PTC嘗味實(shí)驗(yàn)的基本原理 （2）掌握PTC嘗味實(shí)驗(yàn)的基本操作 PTC是一種白色結(jié)晶狀藥物，由于其含有NC=S基團(tuán)而有苦澀味，但對人無毒副作用；不同種族、民族和個體之間，對該物質(zhì)的嘗味能考不同；人體對苯硫脲的嘗味能力是由一對等位基因(Tt

9、)所控制的性狀，T對t為不完全顯性。2實(shí)驗(yàn)原理3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容器材：試管、試管架、滴管。試劑PTC溶液的配制：配制PTC原液，濃度約為1750。PTC嘗味使用液配制：將PTC原液編為1號液，將1號液用蒸餾水稀釋1倍編為2號液，將2號液再稀釋一倍編為3號液，以此類推，直至配成14號PTC溶液，14號液濃度為16 000 000，將配好的14種不同濃度的PTC溶液分別置于消毒好的白色試劑瓶內(nèi)。(1)器材和試劑讓受試者坐在椅子上，仰頭張嘴，用滴管滴510滴14號液于舌根部，讓受試者徐徐下咽品味，并用蒸餾水作對照試驗(yàn)。（2）操作步驟詢問受試者能否鑒別此兩種溶液的味道，若不能鑒別或不能斷定，則依次用13號、1

10、2號溶液重復(fù)試驗(yàn)(應(yīng)注意與蒸餾水交替測試)，直到明確鑒別出PTC的苦味為止。tt基因型的閾值范圍為16號液，Tt基因型的閾值范圍為710號液，TT基因型的閾值范圍為1114號液。為簡化操作程序，也可只用6，7，10，11和13號五種溶液進(jìn)行測試，嘗不出6號苦味者為tt基因型，嘗出7號和10號液的苦味者為Tt基因型，嘗出11號者為TT基因型。統(tǒng)計(jì)所測人員的測試結(jié)果，按HardyWeinberg定律計(jì)算出所測人群中的PTC嘗味基因的基因型頻率和基因頻率。PTC溶液濃度，個體基因型與個體表型的關(guān)系 人類對PTC嘗味能力屬于不完全顯性遺傳(半顯性遺傳),而且已知純合體味盲（tt）容易患結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，

11、因此可以把PTC的嘗味能力，作為一種輔助性診斷指標(biāo)。我國漢族人群中，PTC味盲約占10。小結(jié)二 、 ABO血型檢測（1）了解決定ABO血型的等位基因（2）掌握抗原抗體反應(yīng)檢測ABO血型的原理和方法1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 血型是人體的遺傳性狀，基本的血型系統(tǒng)有16種之多，ABO血型是紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中的一種；它受一組復(fù)等位基因(IA、IB、i)控制。人類的紅細(xì)胞表面有A和B兩種抗原，血清中有抗B()和抗A()兩種天然抗體，依抗原和抗體存在的情況，可將人類的血型分為A，B，AB和O四種血型。 一種血液中紅細(xì)胞在A型標(biāo)準(zhǔn)血清中發(fā)生凝集者為B型，在B型標(biāo)準(zhǔn)血清中凝集者為A型，在兩種標(biāo)準(zhǔn)血清中都凝集者為A

12、B型，在兩種標(biāo)準(zhǔn)血清中都不凝集者為O型。3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容器材：顯微鏡、雙凹玻片或普通載玻片、采血針、青霉素小瓶、膠布、記號筆、牙簽或小玻棒、棉球、小鏡子。試劑：A型(抗B)和B型(抗A)標(biāo)準(zhǔn)血清、70酒精、O.9生理鹽水。(1)器材和試劑(2)操作步驟取一清潔的雙凹玻片(或用普通載玻片用玻璃蠟筆劃出方格代替)，兩端上角分別用記號筆或膠布注明A和B及受試者姓名，然后分別用吸管吸取A和B型標(biāo)準(zhǔn)血清各一滴，滴人相應(yīng)凹格(或方格)內(nèi)。用70酒精棉球消毒受試者的耳垂或指端，待酒精干后，用無菌的采血針刺破皮膚，用吸管取12滴血放入盛有0.30.5 ml生理鹽水的青霉素小瓶中，用吸管輕輕吹打成約5的紅細(xì)胞生理鹽水

13、懸液。 在玻片的每一凹格(或方格)內(nèi)分別滴一滴制好的紅細(xì)胞懸液(注意滴管不要觸及標(biāo)準(zhǔn)血清)，然后立即用牙簽或小玻棒分別攪拌液體，使血球和標(biāo)準(zhǔn)血清充分混勻。在室溫下每隔數(shù)分鐘輕輕晃動玻片幾次，以加速凝集，等1030 min后觀察有無凝集現(xiàn)象。若混勻的血清由混濁變?yōu)橥该?，出現(xiàn)大小不等的紅色顆粒，表示紅細(xì)胞已凝集。若仍呈混濁狀，無顆粒出現(xiàn)，則表明無凝集現(xiàn)象；若觀察不清可用顯微鏡在低倍鏡下觀察；若室溫過高，可將玻片放于加有濕棉花的培養(yǎng)皿中，以防干涸；室溫過低可將玻片置于37恒溫箱中，以促其凝集。表一 ABO血型的凝集反應(yīng)和基因型根據(jù)ABO血型檢查結(jié)果，判斷自己及受檢者的血型。注意事項(xiàng)：標(biāo)準(zhǔn)血清必須有效

14、；紅細(xì)胞懸液不宜過濃或過??；反應(yīng)時(shí)間及溫度要適中，應(yīng)注意辨別假陰性和假陽性。 一般實(shí)驗(yàn)室常用的方法有試管法與玻片法。試管法的優(yōu)點(diǎn)是敏感，較少發(fā)生假凝集；玻片法則簡便易行，但玻片法如控制不好，易發(fā)生不規(guī)則的凝集現(xiàn)象;本實(shí)驗(yàn)用玻片法。三、 常規(guī)性狀的調(diào)查部分人能夠卷舌：舌的兩側(cè)能夠在口腔中向上卷成槽行，甚至卷成筒狀。卷舌著受顯性基因T控制。圖2 卷 舌1、有卷舌 2、無卷舌2. 眼瞼性狀調(diào)查：人群中的眼瞼可以分為單重眼瞼（單眼皮）和雙重眼瞼（雙眼皮）兩種性狀；一般認(rèn)為雙眼皮是受顯性基因控制，位顯性性狀；單眼皮為隱性性狀。3.耳垂性狀調(diào)查：人群中依個體不同，耳朵明顯區(qū)分為有耳垂和無耳垂，有耳垂為顯性

15、性狀，受一對等位基因控制，無耳垂的為隱性性狀。4.額前發(fā)際調(diào)查：有些人的額前的發(fā)際明顯的在前額正中發(fā)際向下延伸呈峰形，成V字型（又稱美人尖），屬于顯性；而額前發(fā)際基本屬于平線的屬于隱性。圖3前額中央發(fā)際有一三角形突出稱美人尖1、有美人尖 2、無美人尖5.發(fā)式和發(fā)旋的調(diào)查：人群中發(fā)式有直發(fā)和卷發(fā)之分，其中直發(fā)為隱性性狀，東方人多是此性狀；卷發(fā)屬于顯性性狀。人群中的發(fā)旋螺紋方向受遺傳因素控制，順時(shí)針方向?yàn)轱@性性狀，逆時(shí)針為隱性性狀。6.拇指端關(guān)節(jié)外展的調(diào)查：人群中某些人的拇指的最后一節(jié)能夠彎向橈側(cè)，與拇指垂直軸線呈60度，該性狀為純合隱性性狀。圖4 拇指豎起時(shí)彎曲情形1、挺直 2、拇指向指背面彎曲

16、7.達(dá)爾文結(jié)節(jié)的調(diào)查：人群中有些人的耳輪邊緣上有一個（或2個及其以上）小的突起成為達(dá)爾文結(jié)節(jié)，該性狀為顯性性狀。1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）了解皮膚紋理的形成與遺傳的關(guān)系（2）掌握皮紋的印取和皮紋的類型四 、 人類皮紋的觀察分析 皮膚紋理(dermatoglyph)簡稱皮紋。是指人體某些特殊部位，如手指、手掌、腳趾和腳掌等處皮膚上出現(xiàn)的紋理圖形。它是由真皮乳頭向表皮突起，形成的一條條凸起的乳頭線，其上有汗腺開口，稱嵴紋(ridge)；各嵴紋間凹下的部分稱為溝，這些凸凹的嵴和溝就構(gòu)成特定的指紋和掌紋。2實(shí)驗(yàn)原理 一般認(rèn)為，人的皮紋終生不變；每個人都有其特定的皮紋，故有種族和個體的差異，因此皮紋長期以來作為偵

17、破案件的手段之一。 大量的研究表明，某些遺傳病，特別是一些染色體病、先天性代謝病和先天畸形等常伴有皮膚紋理異常，故皮紋檢查可作為某些遺傳病診斷的輔助指標(biāo)。3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(1)器材和試劑器材：放大鏡、量角器、直尺、鉛筆、紅色印油(或黑色油墨)、人造海綿墊、搪瓷盤、八開白紙。試劑：2.5亞鐵氰化鉀KFe(CN)6水溶液、2三氯化鐵(FeCl3)水溶液。將紅色印油適量地倒入瓷盤的海綿墊上，涂抹均勻，再將白紙平鋪于桌面或玻璃板上，準(zhǔn)備取印。受檢者洗凈雙手，擦干后將手掌按在海綿墊上，使掌面獲得均勻的印油(注意不要來回涂抹，印油不宜粘得過多)。(2)操作步驟取印時(shí)先將掌腕線放在白紙上，然后從后向前依掌、指順序逐步放下，手指自然分開，適當(dāng)用力按壓手背，尤其是腕部、掌心及手指基部，以免漏印。提起手掌時(shí)，先將指頭翹起，爾后是掌和掌腕面，這樣便可獲得滿意的全掌皮紋。注意，取印皮紋時(shí)不可加壓過重，不可移動手掌和白紙，以免使皮紋重疊或模糊不清。滾動式印取指紋。將印好的左、右手掌紋紙移至桌邊或玻板邊緣，然后在對應(yīng)的掌紋下方，由左至右依次按印10個手指指尖皮紋。印時(shí)，取印的指頭伸直，其余四指彎曲，將手指由一側(cè)向另一側(cè)輕輕滾動(切勿來回滾動，以免圖像重疊)，以便將指尖兩側(cè)皮紋印上，記下10個指尖的順序。(