免疫組織化學染色技術教學課件

1、熟悉而又陌生的世界免疫學制作內(nèi)容第1頁，共59頁。醫(yī) 學 免 疫 學第27章 免疫組織化學技術 主講教師：王興名 主講教師：王興名 主講教師：王興名 主講教師：王興名 2014-04-15主講教師：王興名 指導教師：王洪江老師第2頁，共59頁。 35歲女性，左頸淋巴結腫大，CT掃描未發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶？臨床如何處理？實例行免疫組化染色：腫瘤細胞CK7（-），CK20(+)，CDX2（+），提示結直腸來源。免疫組化：協(xié)助臨床診斷！活檢：提示為腺癌（轉移性）腸鏡檢查在橫結腸發(fā)現(xiàn)12mm的病灶，活檢證實為腺癌。（ CK7和CK20聯(lián)合應用）第3頁，共59頁。作用靶點腫瘤類型Tratugumab(赫賽汀）HE

2、R2乳腺癌和胃癌Cetuximab（艾比妥）EGFR結腸癌，非腺癌Bevacizumab（阿瓦斯汀）VEGF轉移性大腸癌，腎癌Lmatinib（格列衛(wèi)）C-Kit胃腸道間質(zhì)瘤，慢粒Rituximab（美羅華）CD20淋巴瘤某些免疫標志物決定是否使用靶向藥物治療免疫組化-指導臨床治療方向！第4頁，共59頁。 有利于課題設計和研究工作的開展！第5頁，共59頁。？免疫組織化學技術第6頁，共59頁。第27章 免疫組織化學技術Immunohistochemistry 第五節(jié) 免疫金銀法第四節(jié) 熒光免疫組織化學技術第三節(jié) 酶免疫組織化學染色第二節(jié) 免疫組織化學的關鍵技術本章主要內(nèi)容第一節(jié) 概述第7頁，共5

3、9頁。第一節(jié) 概述第二節(jié) 免疫組織化學的關鍵技術（學習難點） 第三節(jié) 酶免疫組織化學染色本次課程任務免疫組化的概念及原理 （重點掌握）免疫組化分類（了解）常用免疫組化方法（熟悉）免疫組化特點（熟悉）第8頁，共59頁。【教學目的與要求】教學目的： 免疫組織化學染色技術是一項非常成熟的蛋白檢測技術，廣泛應用于臨床檢測，其所應用的抗原抗體反應，更是很多其他免疫實驗的理論基石。因此通過本次授課，要讓同學掌握該項實驗原理，做到融會貫通。教學要求： 掌握免疫組織化學染色技術的概念和原理； 熟悉免疫組織化學染色技術的步驟、方法及操作步驟。 了解免疫組化技術的重要用途及相關其他技術（拓展）。第9頁，共59頁。

4、第一節(jié) 概述免疫組織化學技術的概念和原理（理解掌握） 1免疫組織化學技術分類（了解） 2常用染色方法（熟悉） 3免疫組織化學技術特點（熟悉） 4第10頁，共59頁。一、免疫組織化學的概念及原理（重點掌握）（一）概念 ：免疫組織化學 immunohistochemistry 將顯示劑（熒光素、酶、金屬離子等）標記的特異性抗體在組織或細胞原位通過抗原抗體的特異性反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定位、定性及定量測定的一項技術。 綜合兩門技術，并借助顯微鏡檢測各種物質(zhì)。 第11頁，共59頁。本質(zhì)：組織化學染色+原位示蹤技術發(fā)展歷程：免疫熒光法-酶標抗體技術酶抗酶復合物技術膠體金標記技術以及親和

5、標記技術-出現(xiàn)原位雜交技術及PCR技術。 第12頁，共59頁。（二）免疫組織化學原理（重點掌握）1.（回顧）理論基礎：（1）抗原（antigen）是一類能刺激機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，即產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞等，并能與相應抗體或致敏淋巴細胞在體內(nèi)或體外特異性結合的物質(zhì)。兩大特性：免疫原性、免疫反應性。第13頁，共59頁。外源性抗原：微生物、花粉等內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫瘤相關抗原等同種異型抗原：人類白細胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動物、植物等之間存在的共同抗原抗原處處在第14頁，共59頁。（2）抗體（antibody）機體受抗原刺激后由B淋巴細胞,特別是漿細胞分泌產(chǎn)生的一種能與

6、相應抗原發(fā)生特異性反應的球蛋白，稱為免疫球蛋白。 特性：能夠與相關抗原特異性結合。第15頁，共59頁。（3）酶促反應：II抗用酶標記（如辣根過氧化物酶等），與底物發(fā)生酶促反應。 酶促反應的特點：高效性 特異性 操作簡單 條件可控。第16頁，共59頁?？偨Y：（1）+（2）+（3）=免疫組織化學的優(yōu)點：第17頁，共59頁。免疫反應+組織化學 結合的產(chǎn)物1.利用了免疫學基本原理：抗原與抗體結合的高度特異性2.借助化學顯色方法2.免疫組化染色原理：第18頁，共59頁。具體的反應原理? 提取靶蛋白（作為抗原） 獲得鼠I抗獲得II抗實驗動物酶或生物素酶或生物素酶或生物素標記性II抗標記性II抗顯色顯色DA

7、BDAB顯色第19頁，共59頁。根據(jù)標記抗體種類不同 根據(jù)染色步驟分類 根據(jù)結合方式：抗原抗體結合： 如：過氧化物酶-抗過氧化物酶法（PAP法） 親和連接二、免疫組織化學分類第20頁，共59頁。 酶-免疫酶法 熒光染料-免疫熒光法 鐵蛋白-免疫鐵蛋白法 膠體金-免疫金銀法 放射性同位素-放射免疫法根據(jù)標記抗體不同：第21頁，共59頁。根據(jù)染色步驟直接法：例-免疫熒光探針間接法：是將酶標記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測組織或細胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。 例：兩步法，三步法及多步法 優(yōu)點：提高靈敏度，同時避免多次標記I抗 圖例第22頁，共59頁。間接法:靈敏性三步法、兩步法直接法：

8、特異性一步法第23頁，共59頁。根據(jù)結合方式：抗原-抗體結合：例如過氧化物酶-過氧化物酶復合物法親和連接法：ABC法 S-P法第24頁，共59頁。免疫熒光法免疫酶標方法免疫膠體金技術三、較常用的免疫組織化學方法第25頁，共59頁。1.原理：抗原抗體特異性結合 用熒光素標記I抗進行反應。2.特點：熒光顯微鏡下觀察免疫熒光法第26頁，共59頁。1.目前應用最為廣泛2.原理：抗原抗體反應，酶標記抗體，加底物顯色3.特色：準、清、久、兼容。免疫酶標方法第27頁，共59頁。1.標記物：特殊的金屬顆粒-膠體金2.特性：特別適用于電鏡的單標記或多標記。也適用于光鏡研究。免疫膠體金技術電子顯微鏡膠體金包埋后染

9、色第28頁，共59頁。四、免疫組化技術特點：（熟悉）1.原位性2.顯色反應3.形態(tài)、代謝和功能三結合4.定性、定位和定量三位一體5特異性強6.敏感性高第29頁，共59頁。原始位置的反應：細胞層面膜、核、漿 細胞器層面2.顯色反應根據(jù)標記的種類不同，顯色效果不同： 熒光標記-熒光素顯色 酶標記-酶底物顯色 膠體金技術光鏡、電鏡均顯色1.原位性第30頁，共59頁。形態(tài)顯色反應代謝、功能抗原含量及位置4.定性、定量及定位三位一體存在嗎？在哪里？有多少？3.形態(tài)、代謝和功能三結合第31頁，共59頁。原理決定該特點“免疫組織化學實際是組織中特定抗原的顯示！”6、敏感度高ABC法、SP法可使抗體稀釋上千倍

10、、上萬倍后仍可與組織中抗原結合。5.特異性強第32頁，共59頁。小結免疫組化技術的原理第33頁，共59頁。用下圖來說明以上基本原理：第34頁，共59頁。免疫組化具體怎么做的呢？第35頁，共59頁。Company Logo第二節(jié)、第三節(jié) 免疫組織化學技術基本步驟（難點，實用性強） 二抗孵育組織包埋一抗孵育封閉抗原修復滅活組織脫蠟顯影取材、固定制片結果判讀長第36頁，共59頁。時間：標本離體后30min內(nèi)取材，并用固定液固定；目的：保持組織的形態(tài)和結構的完整；盡量保存組織中的抗原方法：4%甲醛溶液機理：使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而起固定作用 ,影響細胞膜通透性,抑制酶的消化作用，從而保護蛋白質(zhì)免受破壞）1.

11、取材、固定2.組織包埋目的：使組織保持一定的形狀和硬度, 易于切片方法：有多種，如石蠟包埋、冷凍包埋、塑料包埋等第37頁，共59頁。切片： 4um厚度（相當于單層細胞厚度），并粘附于載玻片?？酒?70 2h，目的-充分貼附3.制片4.脫蠟脫蠟：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二甲苯水化、洗滌：PBS浸泡 5min第38頁，共59頁。 目的：暴露抗原,提高通透性,增強特異性染色方法：高壓修復，檸檬酸鈉鹽緩沖液，PH=6.0 , 0.01M 另外其他方法：消化酶修復、微波修復、煮沸等等。PBS洗滌 3次5.滅活6.抗原修復3%H2O2溶液，室溫10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性第

12、39頁，共59頁。目的：消除非特異性染色（存在內(nèi)源性熒光、內(nèi)源性酶，內(nèi)源性生物素、抗體或標記物不純、過量等）方法：正常山羊血清封閉液封閉，室溫下，10min。傾去血清適當比例稀釋I抗，37孵育1h或4冰箱過夜。PBS洗滌 2min*3次7.血清封閉封閉后勿洗滌！8.特異I抗孵育9.II抗孵育滴加生物素化II抗工作液50-100ul室溫孵育20分鐘，PBS洗滌2min*3次第40頁，共59頁。11、滴加顯色劑：如DAB ，室溫，5min左右。注意：光鏡下掌握染色時間；流水沖洗 5min10.滴加底物采用的方法不同，底物有一定差異.后面詳細分析11.滴加顯色劑第41頁，共59頁。蘇木素復染（細胞核

13、0.1%鹽酸-乙醇溶液分化12.復染13.“成片”流水充分沖洗梯度酒精脫水中性樹膠固定，封片，晾干后鏡檢。第42頁，共59頁。結果判讀要考慮以下幾個方面 A、定位：細胞質(zhì)（為主），細胞膜，細胞核，細胞間質(zhì) B、陽性細胞數(shù) C、染色強度最后一步：結果判讀第43頁，共59頁。光學顯微鏡下結果判斷判讀舉例：食管鱗狀細胞癌 CD44蛋白強陽性表達，表達位置：細胞質(zhì)乳腺癌，癌細胞核內(nèi)ER強陽性表達第44頁，共59頁。在有轉移的HCC中，VEGF呈強陽性表達 ABC 200人甲狀腺癌CD44V6染色，胞膜陽性，SP法，DAB染色第45頁，共59頁。ABC法抗生物素-生物素免疫染色法理論基礎：卵白素：亦程抗

14、生物素，親和素。有四個同生物素親和力極高的結合點。 生物素：即機體內(nèi)維生素H。 1.可以與卵白素高親和力結合； 2.可以和抗體IgG的Fc段結合，但不影響抗體活性； 3.活化后可與過氧化物酶等結合，也不影響酶活性ABC試劑盒ABC試劑盒1 .封閉用血清2.生物素標記II抗3.A試劑： 卵白素（抗生物素）4.B試劑：生物素-過氧化物酶復合物第46頁，共59頁。Biotinylated second antibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimary antibodyIllustration of ABC methodAvidin-biotin-pe

15、roxidase complex第47頁，共59頁。sp法基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同：是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原第48頁，共59頁。AgAgBiotinStreptavidinEnzyme: HRP or APPrimary antibodyBiotinylated secondary antibodyIllustration of SP methodSP complex第49頁，共59頁。 EnVison系統(tǒng)染色原理II抗多聚螯合物酶形成多聚螯合物含有大量酶和II抗分子放大效果好背景著色極淺第50頁，

16、共59頁。AgAgPrimary antibodySecondary antibodyEnzyme, AP or HRPIllustration of EnVision method第51頁，共59頁。小復習：組織內(nèi)抗原酶標II抗特異性I抗顯色劑第52頁，共59頁。 免疫組織化學在臨床診療中的應用（了解）用于鑒別腫瘤的組織來源細胞受體檢測病毒性抗原檢測癌基因、抑癌基因蛋白與生長因子檢測重新認識某些腫瘤的組織發(fā)生、發(fā)病機制第53頁，共59頁。器官或組織特異性抗原標記物 前列腺標記物： PSA， PSAP，PSMA，P504s甲狀腺標記物：TG，CT，TTF-1甲狀旁腺：PTH黑色素細胞標記物：MB45，S100，MelanA肺腺癌的標記物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A肝細胞癌標記物：Hep-1乳腺： Mammaglobio，GCDFP15結腸： CDX2，B-catenin宮頸癌：P16第54頁，共59頁。癌可能的起源較常見的臨床情況：淋巴結或其它部位不明起源的轉移癌卵巢腺癌，懷疑為胃腸道癌轉移膀胱腺癌，懷疑為侵犯/轉移的前列腺癌或結腸癌有結腸癌病史的患者肺部有一孤立性結節(jié)：結腸癌轉移還是新的肺原發(fā)性腫瘤？第55頁，共59頁。卵巢腺癌：原發(fā)還是腸起源?卵巢起源腸起源CK7+CK20 (但常會黏液腺癌陽性表達)+CD