MS基礎(chǔ)知識(shí)解析課件

1、質(zhì)譜知識(shí) 丁俊杰 Thursday, August 4, 2022第1頁，共46頁。質(zhì)譜分析法是通過測(cè)定被測(cè)樣品離子的質(zhì)荷比來對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性定量分析的一種方法。1906年，JJThomson “Father of mass spectrometry”質(zhì)譜是唯一可以給出分子量, 確定分子式的方法, 而分子式的確定對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定是至關(guān)重要的。 發(fā)展第2頁，共46頁。歷史1906年 J.Jthomson于1912年制造出第一臺(tái)質(zhì)譜儀1946年 發(fā)明飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(Time-of-flight Analyzer)1953-1958年 出現(xiàn)四極桿質(zhì)量分析器(Quadrupole)1956年 G

2、C-MS開始聯(lián)用1959年 質(zhì)譜首次用于肽序測(cè)定1965年 離子共振質(zhì)譜出現(xiàn)1968年 電噴霧離子源1973年 LC-MS1974年 Fourier transform ion cyclotor resonance MS1987-1988年 Matrise assisted laser desorption ionization1996年 電噴霧離子源開始用于生物大分子的研究第3頁，共46頁。Nobel Prize in MS第4頁，共46頁。LC-MS 檢測(cè)回答分析化學(xué)中最常見的問題定性 - 樣品中有什么?定量- 樣品中有多少?第5頁，共46頁。藥物色譜分析中不同方法的比例1990 年 20

3、00 年數(shù)據(jù)來源：American Society for Mass Spectrometry, 2002第6頁，共46頁。MSOMSGC-MSLC-MSQuadrupoleSSQTSQQ-Trap(3級(jí))OrbitrapIon trap3D ITLITTOFQ-TOFSYNAPTTOF/TOFIT-TOFMALDI-TOF/MSFT-MSIMSDFA-MSICP-MSSIMS分類Orbitrap:實(shí)現(xiàn)離子分離、裂解和多級(jí)質(zhì)譜MSn功能，提供精確的質(zhì)量分析和高分辨率檢測(cè)SYNAPT:系統(tǒng)將UPLC分離、高效離子淌度（IMS）和正交飛行時(shí)間質(zhì)譜融合IMSUPLC靜電場(chǎng)阱第7頁，共46頁。LC-M

4、S聯(lián)用系統(tǒng)的組成由機(jī)械真空泵(前極低真空泵)，擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度低。第8頁，共46頁。離子源電子轟擊源（Electro-Impact source, EI）化學(xué)電離源（Chemical Ionization, CI）場(chǎng)致電離源（Field Ionization, FI）場(chǎng)解吸電離源（Field Desorption, FD）快原子轟擊（Fast atom bombardment, FAB） 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)機(jī)的接口大氣壓電離源（Atmospheric Pressure Ioni

5、zation, API）電噴霧電離（Electro Spary Ionization, ESI）& nano-ESI大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI）大氣壓光噴霧電離(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization, APPI）基質(zhì)輔助激光解析電離（matrix-assisted laser desorption-ionization, MALDI）第9頁，共46頁。分子量非極性極性EI/CIESIAPCI100,0001000哪種離子化方式?APPIMALDI第10頁，共46頁。

6、質(zhì)量分析器扇形磁場(chǎng)分析器 (Sector Magnetic )四級(jí)桿分析器（quadrupole）離子阱(ion trap, IT)飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（Time of flight, TOF）傅立葉變換離子回旋共振(Fourier transform-ion cyclotron resonance, FT-ICR) 第11頁，共46頁。種類檢測(cè)參數(shù)質(zhì)量范圍(Da)質(zhì)量精度(Da)真空(Pa)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)扇形磁場(chǎng)動(dòng)量/電荷比50-200000.0000110-4高可靠性不適合聯(lián)用Quadrupole質(zhì)核比50-30000.1 10-3體積小，成本低不適合MALDIIon trap頻率50-20000

7、.1 10-3多級(jí)（1-5）質(zhì)量范圍小1/3效應(yīng)TOF飛行時(shí)間50-3000000.000110-4高分辨，高掃描速度對(duì)于ESI適應(yīng)性較差FT-ICR頻率50-100000.00001 10-7高分辨，多級(jí)價(jià)格昂貴質(zhì)量分析器比較第12頁，共46頁。MS Family進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器MALDIESITOFIon Trap (IT)Quadrupoles (Q)FTMSMALDI-TOF; MALDI-TOF/TOFESI-TOFESI-Qq-TOFESI-Ion TrapESI (or MALDI or .) FTMSESI (or MALDI or .) Q-q FTMSESI-tri

8、ple QuadrupolesMany other hybrid configurations不同類型GCHPLCUPLC雜化的分析器(hybrid MS) quadrupole + TOF（Q-TOF） TOF+TOF (TOF/TOF) quadrupole + ion trap（Q-trap） (Orbitrap)第13頁，共46頁。Suppliers of LC-MSThermo-Fisher (USA) AB (USA) （被Invitrogen 收購(gòu)）Bruker Daltonics (Germany) Waters (USA) Varian (USA) Agilent (USA)

9、 Shimadzu (JAPAN) 第14頁，共46頁。我們接觸的質(zhì)譜UPLC-MS/MS：AB2000 Quattro micro, 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LC-IT/MS： Thermo LCQ Fleet, 離子阱質(zhì)譜儀離子源電噴霧電離源 Electrospray Ionization (ESI)大氣壓化學(xué)電離源 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)第15頁，共46頁。兩種離子源的比較種類ESIAPCI電離機(jī)理離子蒸發(fā)高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生離子MH+ 和加和峰MH+或M-H-液相流速0.2-0.3 mL/min0.2-1 mL/mi

10、n斷裂程度低溫?zé)岵环€(wěn)定的化合物會(huì)分解多電荷能不能質(zhì)量范圍可以到幾十萬98%)，然后用合適的溶劑(MeOH, ACN, H2O)使?jié)舛确秶?-20g/mL。高速離心轉(zhuǎn)移后便可以掃描 。 （盡量不用DMF&DMSO&吡啶&丙酮）掃描時(shí)正負(fù)離子均要掃描，以便于解析結(jié)果，掃描范圍要達(dá)到預(yù)計(jì)分子量的3倍純度足夠的話是不用加色譜柱的，如果不夠可以連色譜柱做全掃描 Full scan 第19頁，共46頁。常見的準(zhǔn)分子離子峰正離子模式檢測(cè)負(fù)離子模式檢測(cè)M + H+ 酸性條件M - H+M + Na+ ; M + K+ 鹽存在M + Cl- M + NH4+ NH4緩沖鹽M + X+ X=溶劑或緩沖液陽離子M

11、 + X+ X=溶劑或緩沖液陽離子2M + H+ 高濃度下2M + Na+ 高濃度下2M + K+ 高濃度下M + H+S+ 溶劑加合M - H+S+ 溶劑加合物M + 2H2+ (甲醇32, 乙腈41 ,甲酸46,乙酸60)第20頁，共46頁。一些有用的規(guī)律正離子模式檢測(cè)M + H+=M + 1M + NH4+ =M + 18M + Na+=M + 23M + K+ =M + 39M +HCOOH+ H+=M + 47 M +CH3COOH+ H+=M + 61M +CH3OH+ H+=M + 33M +CH3CN+ H+=M + 42M + 2H2+=(M +2)/2(甲醇32, 乙腈41

12、 ,甲酸46, 乙酸60)負(fù)離子模式檢測(cè)M - H-=M - 1M + Cl- =M + 35M +H2O - H-=M + 17M +HCOOH - H-=M + 45 M +CH3COOH - H-=M + 59M +CH3OH - H-=M + 31M +CH3CN - H-=M + 40第21頁，共46頁。M+H+129.1 + c Full ms 240.00-2000.003004005006007008009001000m/z020406080100Relative Abundance415.3456.2278.9437.3MW 414 M+H+CH3CN+加合離子的質(zhì)譜圖舉例(

13、+)MW 128 M+NH4+ + c Full ms 50.00-600.00100200300400500600m/z020406080100Relative Abundance567.7292.8568.8293.9572.5566.5470.0338.7460.0256.1199.299.2MW 275M+H+221.1 + c Full ms 50.00-500.0050100150200250300350400450500m/z020406080100Relative Abundance463.1441.2439.2322.2360.5213.890.3145.0243.2MW 2

14、20M+Na+2M+H+2M+Na+2M+NH4+第22頁，共46頁。(E) Doubly charged ion: M+2H2+ + c Full ms 240.00-1000.003004005006007008009001000m/z020406080100Relative Abundance350.1699.2278.9(MW 698)正離子檢測(cè)方式第23頁，共46頁。 + c Full ms 50.00-1000.002004006008001000m/z020406080100Relative Abundance448.9471.0690.1224.8241.8695.2MW 22

15、4第24頁，共46頁。 M H - c Full ms 50.00-500.0050100150200250300350400450500m/z020406080100Relative Abundance220.8221.9340.9256.5339.1219.0441.878.9467.0MW 222負(fù)離子檢測(cè)方式 - c ESI Full ms 50.00-800.00100200300400500600m/z020406080100Relative Abundance458.8228.9185.0274.8170.2169.2457.9460.8275.8324.8273.8563.34

16、17.02M H MW 230天麻素(MW 286)MH 第25頁，共46頁。天麻素的一級(jí)負(fù)離子掃描圖M=286M-H= 285M-H+H2O= 303 ?M+Cl= 321M-H+HCOOH= 331第26頁，共46頁。（1）選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM） SIM用于檢測(cè)已知或目標(biāo)化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標(biāo)化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。 若幾種目標(biāo)化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測(cè)，那么可以同時(shí)測(cè)定幾種離子。第27頁，共46頁。LC/PDA = 254 nmLC/MS = 228 m/zLC/MS = 162 m/zLC/MS = 198 m/

17、z和液相的比較SIM fixed 第28頁，共46頁。接觸的質(zhì)譜LC-MS/MSUPLC-MS/MS：AB Quattro micro，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀CID：collision-induced dissociation第29頁，共46頁。接觸的質(zhì)譜LC-MS/MS-三重四極桿工作模式模式Q1Q2Q3用途和特點(diǎn)Q1掃描掃描離子不打碎，傳輸無分辨，傳輸了解樣品基本信息子離子掃描固定過濾母離子打碎母離子掃描子離子研究母離子的結(jié)構(gòu)特征母離子掃描掃描母離子打碎母離子固定過濾子離子篩選具有特征子離子（結(jié)構(gòu)）的分子中性丟失掃描母離打碎子離子掃描子離子，與母離子有特征差異篩選有特征結(jié)構(gòu)的分子，此結(jié)構(gòu)不易形成

18、子離子單離子監(jiān)視SIM按表過濾離子不打碎，傳輸無分辨，傳輸定量多反應(yīng)檢測(cè)MRM按表過濾母離子打碎母離子按表過濾子離子定量，假陽性低第30頁，共46頁。（3）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)Multiple Reaction Monitoring (MRM)母離子和子離子均選定，定量專用第31頁，共46頁。母離子分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會(huì)生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。 （4）母離子掃描PAR Scan 第32頁，共46頁。（5）子離子掃描DAU Scan 選定一個(gè)母離子對(duì)這個(gè)母體產(chǎn)生的所有碎片信息進(jìn)行記錄。這種掃描功能在藥物代謝研究

19、中十分重要。 第33頁，共46頁。中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認(rèn)類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測(cè)項(xiàng)目。也可以幫助進(jìn)行未知物結(jié)構(gòu)判斷。(6)中性丟失掃描CNL Scan 質(zhì)量數(shù) 中性丟失質(zhì)量數(shù) 中性丟失2 H2 HCHO17 NH334 H2S18 H2O HCl HF44 CO2 HCN74 C3H6O228 CO/C2H480 HBr第34頁，共46頁。注意事項(xiàng)1.定量都是用MRM模式要注意兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)毛細(xì)管電壓和裂解電壓2.定性會(huì)用到所有的功能仍然要注意裂解電壓，如果做代謝的話有用到很多常量參數(shù)第35頁，共46頁。接觸的質(zhì)譜LC-IT/MSLC-IT/MS：Thermo

20、 LCQ Fleet LC/MS，是美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，離子阱質(zhì)譜儀SIRMRMMS(n)Auto MS(n)第36頁，共46頁。離子阱的信號(hào)衰減，一般做到4-5級(jí)1/3 cut-off of mass-to-charge ratio接觸的質(zhì)譜LC-IT/MS第37頁，共46頁。如何選擇LC-MSLC-MS/MSLC-IT/MSLC-Q/TOF-空間上串聯(lián)時(shí)間上串聯(lián)空間上串聯(lián)主要功能Full ScanSIMFull ScanSIMSRMPAR scanDAU scanCNL scanFull ScanSIMSRMMS(n)(n=1-5)Auto MS(n)Full ScanSIMSRMM

21、S(2)Auto MS(2)特點(diǎn)價(jià)格實(shí)惠MRM靈敏度高多級(jí)信息，全掃描靈敏精確分子質(zhì)量，高分辨適用性均一般定量(某些定性)定性定性，大分子第38頁，共46頁。分析條件的移植1.接口的選擇： ESI APCI2.正、負(fù)離子模式的選擇：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對(duì)樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負(fù)離子模式：適合于酸性樣品。樣品中含有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。第39頁，共46頁。3.流動(dòng)相的選擇常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物L(fēng)C-MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液 甲酸（乙酸） 0.2 三氟乙酸 0.1。 含三乙胺 l。 醋酸銨 5-10 mmoL/L4.流量和色譜柱的選擇ESI的最佳流速0.2-0.3 mL/min 應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流目前大多采用 1-2.1 mm內(nèi)徑的微柱APCI的最佳流速0.8-1 mL/min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適第40頁，共46頁。樣品的預(yù)處理常用方法a）超濾b）溶劑萃取/去鹽c）固相萃取d）甲醇或乙腈沉淀蛋白e）酸水解，酶解f）衍生化分析條件的移植第41頁，共46頁?；|(zhì)效應(yīng) matrix effect離