生命起源與進(jìn)化：09蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化及抗體庫技術(shù)

1、蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化DNA Shuffling技術(shù)抗體庫技術(shù) 第九章 蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化及抗體庫技術(shù) 1 蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化基因的直接進(jìn)化蛋白質(zhì)分子進(jìn)化的基本步驟蛋白質(zhì)分子進(jìn)化的用途從自然界中篩選人工誘變誘變對象是生物體，本質(zhì)上是生物基因組的誘變蛋白質(zhì)工程在分子水平上，對蛋白質(zhì)改性。如何獲得新的蛋白質(zhì)、提高酶的活性？（從頭設(shè)計(jì)：完全根據(jù)現(xiàn)有知識）蛋白質(zhì)工程的三個(gè)基本策略（理性設(shè)計(jì)：根據(jù)酶的3D結(jié)構(gòu)）（分子進(jìn)化：是一種人工加速的隨機(jī)突變過程）基因的直接進(jìn)化（directed evolution) 可使已有基因獲得新的特性 可獲得自然界中不存在的基因 可解決許多新的理論和應(yīng)用問題基因直接進(jìn)化的用途提高酶活

2、性天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對映異構(gòu)體選擇性酯酶可水解非天然酯類改善酶的工藝性冷適應(yīng)和熱適應(yīng)酶改變酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)二體酶變?yōu)閱误w酶獲取許多新的理論知識部分研究成果類 型示 例特 性活性增加倍數(shù)潛在應(yīng)用領(lǐng)域蛋 白綠色熒光蛋白熒光強(qiáng)度45基礎(chǔ)研究重組蛋白RecA重組率100基礎(chǔ)研究抗 體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化特異性10，000生物制藥 -內(nèi)酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65耐熱時(shí)間17200工業(yè)酶細(xì)胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞

3、代謝途徑汞解毒12生物制藥TLPs（同序植酸酶 ） 的失活曲線親代真菌植酸酶的最適溫度為45-55，而同序植酸酶的最適溫度為71，增加了16-26。TLP-ste突變蛋白的三維結(jié)構(gòu)酶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化建立基因突變庫；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能的展示；篩選；基本步驟：建立新庫許多蛋白具有共同架構(gòu)；蛋白質(zhì)間的相互作用界面具有柔性；蛋白質(zhì)間的相互作用具有關(guān)鍵位點(diǎn)。展示蛋白架構(gòu)環(huán)肽抗體細(xì)菌受體DNA結(jié)合蛋白蛋白酶抑止劑縮微蛋白隨機(jī)突變（隨機(jī)合成）點(diǎn)突變定向突變體外的基因突變 2 DNA Shuffling技術(shù)DNA Shuffling機(jī)理易錯PCR法交錯延伸(StEP)技術(shù)Family Shufflingss-DN

4、A Shuffling雙鏈DNA內(nèi)切酶ITCHY技術(shù)外顯子改組Genome Shuffling項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對象進(jìn)化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進(jìn)化緩慢進(jìn)化整個(gè)基因組多年完整基因組高DNAShuffling快速進(jìn)化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組低DNA Shuffling與常規(guī)定向進(jìn)化的比較Flash Play PCR示意圖95變性55退火72延伸2030次循環(huán)無引物PCR克隆單個(gè)基因酶解成小片段有引物PCR純化取30100得突變基因PCR循環(huán)數(shù)增加產(chǎn)物長度增加易錯PCR法(Error-prone PCR) 降低一種dNTP的量（降至5-10） 加入dITP(脫氧肌苷酸)來代替被減少的

5、dNTP 緩沖液中另加0.5mmol/L Mn2+易錯PCR 隨機(jī)引物PCR和重組裝交錯延伸(Stagger extension Process, StEP)在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間,從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行,直到產(chǎn)生完整的基因長度,結(jié)果產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。此方法省去了DNA酶切割成片段這一步,因而簡化了DNA改組的方法。交錯延伸PCR突變法Family Shuffling當(dāng)DNA Shuffling用來改組一系列進(jìn)化上相關(guān)的基因時(shí),就稱為Fami

6、ly Shuffling,此方法中的DNA基因之間要求有一定程度的同源性,一般要求為70%以上。另外,因?yàn)槭嵌鄠€(gè)相關(guān)基因的改組,可以獲得高質(zhì)量的酶的多樣性庫。采用Family Shuffling進(jìn)行基因改組已成為DNA改組的主要方法。ss-DNA Shuffling一般使用ds-DNA做模板,形成的有效重組機(jī)率非常低。ss-DNA Shuffling就是單鏈DNA做模板進(jìn)行Shuffling。為了提高Family Shuffling時(shí)的嵌合率,通過ds-DNA和ss-DNA進(jìn)行Shuffling,結(jié)果顯示ds-DNA的嵌合基因率低于1%;而ss-DNA嵌合率高達(dá)14%,且利用ss-DNA為模板

7、得到的嵌合基因所編碼的蛋白熱穩(wěn)定性更好。經(jīng)典的DNA ShufflingDNA單鏈的DNA Shuffling雙鏈DNA內(nèi)切酶：55由于DNA鏈的延伸只能是按53方向進(jìn)行：第一和第四種分別為自身重退火，第三種為5端退火，這三種均不能延伸。只有第二種是正確的3端退火，得以延伸而形成雜合分子經(jīng)典單鏈雙鏈內(nèi)切酶雜合分子形成的比例ITCHY技術(shù)(Incremental trunction for creation of hybrid enzymes)為了解決不能用于改組同源性低于70%-80%的序列,使得同源性低的序列、甚至非同源性序列間也可以發(fā)生重排。即先將兩個(gè)相關(guān)酶基因經(jīng)單酶切打開一個(gè)切口,目的是

8、給外切酶Exo提供作用位點(diǎn)。Exo每隔一定時(shí)間如30s取一次樣、滅活。然后將兩基因的酶解產(chǎn)物混合,平端連接,即可生成ITCHY庫,ITCHY庫實(shí)際上是產(chǎn)生多樣性庫的一種手段?；?ABABABexoexoABABABblunt endsDNA shuffling ITCHY基因1單酶切打開一個(gè)切口（基因1在B、基因2在A處切開）目的是給外切酶ExoIII提供作用位點(diǎn)。ExoIII每隔一定時(shí)間如30秒取一次樣、滅活。然后基因1和基因2的酶解產(chǎn)物混合，平端連接，即可生成itchy庫，再用經(jīng)典的DNA shuffling處理。Itchy實(shí)際上是產(chǎn)生多樣性庫的一種手段。基因1基因2當(dāng)兩個(gè)基因之間無同源

9、性時(shí)使用這種方法！核酸外切酶 III (E.coli)從3-OH端水解單鏈。它只能作用于雙鏈DNA的以下部位：平端、5-端突出、內(nèi)部切口，而不能作用于突出超過4個(gè)堿基的3-OH端（突出）平端5-端突出內(nèi)部切口（nick)In vitro exon shuffling. In this format, domain-encoding exons (or exon sets) of the target gene and homologs from other, related genes, are amplified using chimeric oligonucleotides. In the

10、 next step, these pre-made DNA fragments are used as both primers and templates in a PCR-like reaction that reassembles the full-length gene. The final step involves the screening of the exonshuffling library for desirable functions or properties.外顯子改組（exon shuffling)Genome Shuffling就是與傳統(tǒng)的進(jìn)化技術(shù)相結(jié)合如原生

11、質(zhì)體融合技術(shù),對整個(gè)基因組進(jìn)行Shuffling,不是對一個(gè)或幾個(gè)基因的改組而是對所有基因的改組,與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相比,它可以對每代的多個(gè)親本進(jìn)行改組,genome Shuffling的改組大大地增加了可改組的空間,可將多個(gè)原基因的有益基因雜合在一起。 3 抗體庫技術(shù)免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基因結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基因重排抗體分子的人源化改造小分子抗體抗體庫的構(gòu)建抗體基因表達(dá)宿主免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)CLCLCH1VLVLVHVHCH2CH3C端N端恒定區(qū)可變區(qū)FC 段Fab段鉸鏈區(qū)補(bǔ)體結(jié)合Fc受體結(jié)合抗原結(jié)合部位1、重鏈和輕鏈 Ig的兩條長鏈稱為重鏈（Heavy chain,

12、H鏈） 重鏈可分為、鏈 Ig的兩條短鏈稱為輕鏈（Light chain, L鏈） 可分為、型。每個(gè)Ig分子的兩條輕鏈完全相同。 IgM IgG IgA IgD IgE 2、可變區(qū)和恒定區(qū)（1) 可變區(qū)（variable region, V區(qū)) ） N端重鏈1/4和輕鏈1/2 組成，AA的種類、排列順序與構(gòu)型變化很大。 VL區(qū)存在3個(gè)超變區(qū)（hypervariable region, HVR13) VH有4個(gè)超變區(qū) 超變區(qū)共同組成Ig 的抗原識別部位，形成與抗原決定基 互補(bǔ)的表位。超變區(qū)也稱互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity- determining region, CD13)。 4個(gè)骨

13、架區(qū)（framework region, FR14). AA替換頻率較低 的的部分。（2）恒定區(qū)：C端重鏈3/4和輕鏈1/2 組成，AA的種類、排列 順序及構(gòu)型相對穩(wěn)定免疫球蛋白Ig的酶解片斷1 木瓜蛋白酶 2個(gè)Fab 段結(jié)合抗原 1個(gè)Fc段 結(jié)合細(xì)胞2 胃蛋白酶 F(ab)2段:雙價(jià)抗體活性 pFc段： 無生物學(xué)活性胃蛋白酶木瓜蛋白酶FcpFcF(ab)2Fab 抗體分子的酶切片段Ig與抗原的結(jié)合區(qū) Ig的基因結(jié)構(gòu)三個(gè)基因簇H重鏈輕鏈輕鏈小鼠輕鏈基因庫的組成小鼠輕鏈基因庫的組成小鼠重鏈基因庫的組成 基因重排V-J基因重排每個(gè)V基因下游有個(gè)CACAGTG-12/23bp-ACAAAAACC序列

14、，而每個(gè)J基因的上游有個(gè)與之互補(bǔ)的序列；在重組酶的作用下，任一個(gè)V基因可以與任一個(gè)J基因重排（發(fā)生在B淋巴細(xì)胞成熟時(shí)）V-D-J基因重排輕鏈基因的重排、RNA處理和蛋白質(zhì)表達(dá)的過程重鏈基因的重排、RNA處理和蛋白質(zhì)表達(dá)的過程 抗體分子的多樣性 抗體分子的人源化改造單克隆抗體技術(shù)的局限：鼠源抗體可能與人體產(chǎn)生排斥反應(yīng)人體的某現(xiàn)特殊抗原無法免疫小鼠雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低抗體基因可變區(qū)基因的克隆：PCR引物應(yīng)具有通用性，能夠與數(shù)百個(gè)VH片斷中的任一個(gè)、6個(gè)JH片斷中的任一個(gè)結(jié)合；引物可選擇可變區(qū)上的保守區(qū)。改型抗體：目的是得到高親和力的治療抗體設(shè)計(jì)嵌和FR(骨架區(qū))人抗體基因庫的應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)的應(yīng)用 抗體的表達(dá)系統(tǒng) 小分子抗體小分子抗體是缺少Fc部分的抗體醫(yī)學(xué)上的優(yōu)缺點(diǎn)可以由E.coli表達(dá)FabFvVH 需要加入前導(dǎo)肽序列，作分泌表達(dá)dsFv(二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體)通過替換Cys，然后在體外引入二