本科《食品生物技術(shù)導(dǎo)論》課件第三章 細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)-2002-

1、第三章 細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)Cell Engineering & Food Industry生吉萍2002.9.26評(píng)說地位和作用：=基因工程細(xì)胞工程：對(duì)生物的基本單位-細(xì)胞的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合，以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至染色體與細(xì)胞器的移植與改建等操作技術(shù)。主要內(nèi)容：細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移等。第一節(jié) 細(xì)胞工程的基本原理與操作1.1 細(xì)胞工程的分類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 工程微生物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞1.2 細(xì)胞的生命特征嚴(yán)格的結(jié)構(gòu) (strict structure)新陳代謝 (metabolism)生長現(xiàn)象 (growth)自我復(fù)制(self-replicati

2、on)-植物細(xì)胞的全能性(totipotency)；動(dòng)物細(xì)胞？細(xì)胞的生命特征(續(xù))應(yīng)激性(emergency)：對(duì)刺激發(fā)生的反應(yīng)遺傳和變異 (heredity & aberrance )適應(yīng)環(huán)境的能力 (acclimation)1.3 細(xì)胞工程的基本操作無菌操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)無菌操作技術(shù)所有實(shí)驗(yàn)都要求在無菌條件下進(jìn)行！如何做到？1）無菌室應(yīng)定期用紫外線或化學(xué)試劑消毒，實(shí)驗(yàn)前后還應(yīng)各消毒一次。2）無菌室外有間緩沖室，實(shí)驗(yàn)人員在此換鞋、更衣、戴帽，做好準(zhǔn)備后方可進(jìn)入無菌室，操作時(shí)實(shí)驗(yàn)者的雙手應(yīng)戴無菌手套。3）注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生整潔。如何做到？4）超凈工作臺(tái)是最基本的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，一切操作

3、都應(yīng)在超凈臺(tái)上進(jìn)行才能達(dá)到較高的無菌要求。5）對(duì)生物材料進(jìn)行徹底的消毒與除菌是實(shí)驗(yàn)成功的前提，實(shí)驗(yàn)所用的一切器械、器皿和藥品都應(yīng)進(jìn)行滅菌或除菌。第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1、定義：是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的保存和生長的技術(shù)。 2、基本過程取材和除菌。淋巴細(xì)胞-直接抽??；動(dòng)植物材料在取材前后，表面清洗、消毒。（有時(shí)還需要某些特定的酶對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生長的細(xì)胞。）根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基并進(jìn)行滅菌。將生物材料接種于培養(yǎng)基。將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。 3、 微生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3.1培養(yǎng)基的組成 碳源 氮源 無

4、機(jī)鹽 維生素 3.2培養(yǎng)基的種類 （1）按成分不同劃分為： 天然培養(yǎng)基(complex medium) 合成培養(yǎng)基(synthetic medium) （2）根據(jù)物理狀態(tài)劃分 固體培養(yǎng)基(solid medium) 半固體培養(yǎng)基(semisolid medium) 液體培養(yǎng)基(1iquid medium) （3） 按用途劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimum medium) 加富培養(yǎng)基(enrichment medium)，也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基。鑒別培養(yǎng)基(Differential medium)選擇培養(yǎng)基(selective medium) 其他培養(yǎng)基3.3培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)（solid-state

5、culture） （2）液體培養(yǎng)（liquid-state culture） （3）連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture（4）中間補(bǔ)料培養(yǎng)(fed-bath culture)（5）同步培養(yǎng)（Synchronous culture ）（6）混合培養(yǎng)（Mixed culture） 4. 植物細(xì)胞培養(yǎng)4.1 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在無菌條件下，將離體的單個(gè)游離細(xì)胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng),以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。 原理植物細(xì)胞的“全能性”-給予適宜的條件可以增殖與分化形成一棵完整植株的能力。4.2植物細(xì)胞體系的建立一般程序?yàn)椋?整體植株-植物組織或器官-外植

6、體-在固體培養(yǎng)基上誘發(fā)愈傷組織-愈傷組織繼代培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)or其他培養(yǎng)方式。 外植體（explant）:用來進(jìn)行組織培養(yǎng)的植物部分。愈傷組織(callus):外植體在組織培養(yǎng)過程中形成的不定形的細(xì)胞團(tuán)。4.3植物細(xì)胞培養(yǎng)基組成無機(jī)鹽類碳源維生素植物生長激素有機(jī)氮源有機(jī)酸一些復(fù)合物質(zhì)組成。包括植物生長所必需的16種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)。植物生長激素大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的或合成的植物生長激素，激素分為兩類：生長素和分裂素。生長素促進(jìn)細(xì)胞生長：吲哚乙酸和萘乙酸。分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂：腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-芐氨基嘌呤和玉米素。分裂素和生長素通常一起使用，來促進(jìn)細(xì)胞的分裂、生長。

7、復(fù)合物質(zhì)這些物質(zhì)通常作為細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)劑。它們有酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁。 培養(yǎng)基的種類在植物細(xì)胞培養(yǎng)中，選擇好的培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，常用的培養(yǎng)基有幾十種。如MS、B5、E1、N6培養(yǎng)基等。其中以MS、B5等應(yīng)用較為廣泛。 4.4 植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法（10.8）單細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng) 搖瓶懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模懸浮培養(yǎng) 是指把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無菌培養(yǎng)。 搖瓶懸浮培養(yǎng)注意事項(xiàng)選擇合適的外植體誘導(dǎo)疏松易碎的愈傷組織選擇合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)液的滅菌懸浮培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的繼代與選擇搖瓶懸浮培養(yǎng)方法分批培養(yǎng)：在新鮮的培養(yǎng)基中加入少量的細(xì)胞培養(yǎng)。（有誘導(dǎo)

8、期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期）半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間以后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換。連續(xù)培養(yǎng)法在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)過程中，不斷抽取懸浮培養(yǎng)液，注入等量的新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。4.5花粉培養(yǎng)過程：無菌條件下取出花藥或從花藥中取出花粉粒-置于人工培養(yǎng)基上-形成花粉胚或愈傷組織-花粉植株（單倍體）4.6 原生質(zhì)體培養(yǎng)過程：纖維素酶或果膠酶除去細(xì)胞壁-原生質(zhì)體-培養(yǎng)基-愈傷組織-誘導(dǎo)出葉、莖、根-完整植株原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用1）提高變異頻率2）為應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)進(jìn)行遺傳重組提供材料，細(xì)胞融合和基因轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)5.1 定義 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指離散的動(dòng)物活細(xì)胞

9、在體外人工無菌條件下的生長增殖，在整個(gè)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。 5.2 培養(yǎng)類型根據(jù)細(xì)胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養(yǎng)的細(xì)胞可分為兩大類：懸浮型和貼附型。懸浮型細(xì)胞是指生長時(shí)呈懸浮狀態(tài)的細(xì)胞;貼附型是指貼附于支持物上生長的細(xì)胞。 5.3 培養(yǎng)基的成分氨基酸 維生素鹽類葡萄糖有機(jī)添加劑。如：核苷、檸檬酸循環(huán)中間體、丙酮酸、脂類及其他各種化合物。 激素和生長因子等。如：血清（小牛血清、胎牛血清、人血清）。5.4 培養(yǎng)過程原料（動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的臟器、肌肉組織）-剪碎-胰蛋白酶消化為單細(xì)胞-洗滌-稀釋-分裝-培養(yǎng)（37，CO2）幾個(gè)名詞從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，稱為

10、原代培養(yǎng)(primary culture).細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程，稱為傳代(subculture)。進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)，稱為傳一代，初次培養(yǎng)的首次傳代成功后，即成細(xì)胞系，一般可傳30-50代。細(xì)胞系的維持，就是通過換液、傳代、再換液、再傳代實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞系的保存一般進(jìn)行冰凍。5.5 應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)：疫苗干擾素激素其他免疫試劑等。第三節(jié) 細(xì)胞融合技術(shù) Cell Fusion Technology1、定義：在一定條件下，將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過程。細(xì)胞融合，又稱細(xì)胞雜交。 動(dòng)物細(xì)胞可以直接融合植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞去壁-原生質(zhì)體（protoplast）-融合原

11、生質(zhì)體的融合2. 細(xì)胞融合過程促融因子作用下-細(xì)胞凝集-細(xì)胞質(zhì)膜粘連-細(xì)胞質(zhì)融合-培養(yǎng)過程中發(fā)生核融合-雜種細(xì)胞物種間雜交、種內(nèi)雜交-基因重組-育種-優(yōu)良品種3. 細(xì)胞融合的方法 1）生物學(xué)法：采用病毒促進(jìn)細(xì)胞融合。如仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、天花病毒等，能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。2）化學(xué)融合法：采用化學(xué)融合劑使細(xì)胞融合。如PEG（聚乙二醇）、DMSO（二甲亞砜）、甘油酸酯等。鈣離子參與。3）電融合法：電場脈沖刺激，使細(xì)胞膜透性增加，促進(jìn)融合。4、微生物原生質(zhì)體融合1）微生物去壁處理：酶法，G+：溶菌酶，G-：溶菌酶+EDTA酵母菌：蝸牛酶Helicase絲狀真菌：纖維素酶，纖維素酶+蝸牛酶霉菌：殼聚糖酶+其

12、他酶（如纖維素酶）2）融合：PEG融合or電融合3）培養(yǎng)：高滲培養(yǎng)基4）檢驗(yàn)重組菌株。5、植物細(xì)胞融合過程細(xì)胞分離-原生質(zhì)體制備-原生質(zhì)體融合-雜種細(xì)胞篩選以及培養(yǎng)-愈傷組織-分化根、莖、葉-完整雜種植株植物原生質(zhì)體融合1）原生質(zhì)體制備取材與除菌-酶解-分離-洗滌-鑒定2）融合： 化學(xué)融合or電融合3）培養(yǎng)：含有滲透壓穩(wěn)定劑的medium培養(yǎng)，產(chǎn)生細(xì)胞壁，轉(zhuǎn)移到生芽、生根medium上，再生植株。4）鑒定顯微鏡鑒別：大小、顏色等?；パa(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞：生長互補(bǔ)、抗性互補(bǔ)、營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)等方法。細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)方法：染色體核型分析、染色體顯帶分析、同工酶分析、核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶片段長

13、度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析等。植株的形態(tài)特征鑒別：高矮、大小、產(chǎn)量、顏色等。6、動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞-融合-雜種細(xì)胞-篩選與鑒定-雜種細(xì)胞克隆篩選方法：藥物抗性、營養(yǎng)缺陷型、溫度敏感性等。第四節(jié) 細(xì)胞重組Cell Recombination：在生物體外，運(yùn)用一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)從活細(xì)胞中分離出各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或組成“部件”，再把他們?cè)诓煌募?xì)胞中重新進(jìn)行裝配，成為具有生物活性的細(xì)胞。1、核移植小鼠的核移植實(shí)驗(yàn)2、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移1）葉綠體移植-高光合作用植物2）線粒體轉(zhuǎn)移-得到線粒體基因的遺傳特性，如抗藥性、雄性不育性等。第五節(jié) 遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移1、載體法：農(nóng)桿菌、PLASMID、PHAGE，2、直接導(dǎo)入法：微注射法、基因槍、電激導(dǎo)入法、激光導(dǎo)入法、花粉管導(dǎo)入法等。第六節(jié) 動(dòng)植物細(xì)胞工程的應(yīng)用舉例1、動(dòng)物細(xì)胞工程至今動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)株