蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定課件

1、蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定 概述凱氏定氮法蛋白質(zhì)的快速測(cè)定法氨基酸總量的測(cè)定氨基酸的分離與測(cè)定概述（1）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用（2）食品中的蛋白質(zhì)含量（3）蛋白質(zhì)系數(shù)（4）蛋白質(zhì)測(cè)定方法概 述（1）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。 人體的酸堿平衡、水平衡的維持； 遺傳信息的傳遞； 物質(zhì)的代謝及運(yùn)轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。 人及動(dòng)物只能從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物來(lái)構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 食品的重要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。(2) 食品中的蛋白質(zhì)含量及測(cè)定意義在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般

2、說(shuō)來(lái)動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%，黃魚為17.0%，帶魚為18.0%，大豆為40%，稻米為8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極重要的意義。（3）蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，分子量很大，大部分高達(dá)數(shù)萬(wàn)數(shù)百萬(wàn)。從組成上看：化學(xué)元素C、H、O 、N（P、S、Cu、

3、Fe）；它們由20種氨基酸通過(guò)酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來(lái)，官能基團(tuán)：肽鍵、氨基酸殘基、酸堿基團(tuán)、芳香基團(tuán)結(jié)論：含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，蛋白質(zhì)的量與氮含量的關(guān)系用蛋白質(zhì)系數(shù)表示： 蛋白質(zhì)系數(shù)每份氮素相當(dāng)于的蛋白質(zhì)的份數(shù)。一般蛋白質(zhì)含氮為16%，所以1份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)。此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用F表示。不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。（4）蛋白質(zhì)系

4、數(shù)三鹿奶粉相關(guān)榮譽(yù) 中國(guó)名牌產(chǎn)品，中國(guó)馳名商標(biāo)，國(guó)家免檢產(chǎn)品，綠色食品，中國(guó)食品工業(yè)百?gòu)?qiáng)，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化國(guó)家重點(diǎn)龍頭企業(yè)，中國(guó)最具價(jià)值的品牌，國(guó)家第一批衛(wèi)生安全食品 。 石家莊三鹿集團(tuán)股份有限公司2008年9月11日晚則發(fā)布產(chǎn)品召回聲明稱，經(jīng)公司自檢發(fā)現(xiàn)2008年8月6日前出廠的部分批次三鹿嬰幼兒奶粉受到三聚氰胺的污染，市場(chǎng)上大約有700噸。 三聚氰胺(melamine) 是一種有機(jī)含氮雜環(huán)化合物，學(xué)名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，或稱為2,4,6-三氨基1,3,5-三嗪，簡(jiǎn)稱三胺、蜜胺、氰尿酰胺，是一種重要的化工原料，主要用途是與醛縮合，生成三聚氰胺-甲醛樹脂，生產(chǎn)塑料，這種塑料不易著火，

5、耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學(xué)腐蝕，有良好的絕緣性能和機(jī)械強(qiáng)度，是木材、涂料、造紙、紡織、皮革、電器等不可缺少的原料。它還可以用來(lái)做膠水和阻燃劑，部分亞洲國(guó)家，也被用來(lái)制造化肥。 三聚氰胺的最大的特點(diǎn)是含氮量很高（66），加之其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本很低，給了摻假、造假者極大地利益驅(qū)動(dòng)，有人估算在植物蛋白粉和飼料中使蛋白質(zhì)增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。所以“增加”產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量是添加三聚氰胺的主要原因，三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒(méi)有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)等也成了摻假、造假者心存僥幸的輔助原因。 化學(xué)性質(zhì)三聚氰胺呈弱堿性（pKa=8），可與多種酸反

6、應(yīng)生成三聚氰胺鹽。遇強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水溶液水解，胺基逐步被羥基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，進(jìn)一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。 毒性： 以前三聚氰胺被認(rèn)為毒性輕微，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3克/公斤體重。據(jù)1945年的一個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)道：將大劑量的三聚氰胺飼喂給大鼠、兔和狗后沒(méi)有觀察到明顯的中毒現(xiàn)象。動(dòng)物長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。 2007年中國(guó)徐州一家出口美國(guó)貓狗食物的企業(yè)在寵物食品中添加三聚氰胺來(lái)冒充蛋白質(zhì)導(dǎo)致中美關(guān)系軒然大波 。 寵物食品污染事件的初步調(diào)查結(jié)果認(rèn)為：摻雜了6.6%三聚氰胺的小麥蛋白粉是寵物食品導(dǎo)致中毒的原因，為上述毒

7、性輕微的結(jié)論畫上了問(wèn)號(hào)。 導(dǎo)致美國(guó)大量寵物死亡，被FDA徹底封殺。（FDA，美國(guó)食品藥品管理局）。 三聚氰胺的分子式是C3H6N6，即氮含量為2/3，按GB/T 5009.5-2003，食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定（凱氏定氮法），乳制品的蛋白氮換算系數(shù)為6.38，即1的蛋白氮含量，折算蛋白質(zhì)含量為6.38，這樣加入3三聚氰胺就蛋白含量“達(dá)標(biāo)”了。 （5）蛋白質(zhì)主要測(cè)定方法有：雙縮脲法染料結(jié)合法酚試劑法 紫外分光光度法水楊酸比色法折光法旋光法近紅外光譜法目前蛋白質(zhì)測(cè)定最常用的方法是凱氏定氮法凱氏定氮法是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含

8、有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍 被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法：常量法、微量法及改良凱氏定氮法 凱氏定氮法的原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。 包括消化、蒸餾、吸

9、收、滴定四個(gè)步驟。 樣品消化： 2 NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4(NH4)2 SO4+6CO2+ 12SO2 + 16H2O 濃硫酸的作用： 脫水作用使有機(jī)物脫水并碳化為C、H、N 氧化作用將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。加入硫酸鉀的作用是：提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解（3380C 4000C） K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)

10、高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來(lái)提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。加入硫酸銅的作用 催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解 C 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 CO2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。 消化完全指示：藍(lán)綠色； 蒸餾 在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣 (NH4)2 SO4 + 2NaOH

11、 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)完全指示：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀 吸收 用硼酸溶液，并加入混合指示劑，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8 X 10-10），與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽，酒紅色藍(lán)綠色 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。 滴定 待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定, 藍(lán)綠色灰紅色 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3討論： 1、實(shí)驗(yàn)中用到哪些試劑？作用是什么？適用范圍：此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定儀器、試劑: 500mL凱氏燒瓶、凱氏定氮裝置 消化用：

12、濃硫酸 硫酸鉀 硫酸銅蒸餾用： 40%氫氧化鈉溶液吸收用： 4%硼酸滴定用： HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑 微量凱氏定氮法操作步驟 樣品消化 蒸餾 吸收 滴定 樣品消化 :準(zhǔn)確稱取一定量的樣品至干燥潔凈的500mL凱氏燒瓶中，加入硫酸銅0.5g（1g）、硫酸鉀10g（3g)和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)粒輕輕搖勻，以45斜支于石棉網(wǎng)上用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處)，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后加大火力(或?qū)糠旁陔姞t上)，保持瓶?jī)?nèi)液體微沸至液體變藍(lán)綠色透明后繼續(xù)加熱微沸30min關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水

13、定容。注意問(wèn)題： 加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸； 消化開始時(shí)不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全； 樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫； 消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。 思考：1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？2、如何判斷消化的終點(diǎn)？ 蒸餾與吸收：按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在吸收瓶中加入10mL 40g

14、/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準(zhǔn)確吸取消化液10mL于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水進(jìn)行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10 min，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸1min蒸餾、吸收注意問(wèn)題：（1）整套裝置不能漏氣，要注意各蒸汽控制夾子的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2）在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。（3）加堿量要足，應(yīng)使消化液呈深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。（4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾；吸收液溫度不應(yīng)超過(guò)40，若超過(guò)時(shí)可置

15、于冷水浴中使用；蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（5）在每次測(cè)定前及兩次測(cè)定之間，均要洗滌反應(yīng)管(倒吸法，在吸收瓶中加入蒸餾水，其余同測(cè)定時(shí)的做法，在蒸汽發(fā)生器中水劇烈沸騰后，立即移開電爐，水即從吸收瓶中倒吸入反應(yīng)管，再倒吸入汽水分離管或蒸汽發(fā)生器中，打開夾子，即可放出廢水。（6）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。 滴定 將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同

16、）。 (4) 結(jié)果計(jì)算 式中 W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； V1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； V2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； m樣品質(zhì)量，g； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)。思考：1、為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和指示劑甲基橙？2、為什么在每次測(cè)定前及兩次測(cè)定之間，均要洗滌反應(yīng)管？如何洗滌？ 常量法 消化：同“微量法” 蒸餾與吸收： 與微量法的不同？滴定：用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mol/L，其余同“微量法”。3.計(jì)算：與微量法的不同？4.注意：同“微量法” 分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理：試樣與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解

17、的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。在pH=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的化合物。在波長(zhǎng)400nm處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0g/L）：精密稱取經(jīng)105干燥的硫酸銨0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,臨用時(shí)用水稀釋至0.1g/L雙縮脲法：雙縮脲的性質(zhì)：當(dāng)脲被小心地加熱至 150160時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成雙縮脲，其與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)測(cè)定原理：蛋白質(zhì)分子中肽鍵（CONH）與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色

18、深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，用吸收光度法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最大吸收波長(zhǎng)為560nm。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，靈敏度低，常用于生物化學(xué)領(lǐng)域。 雙縮脲法1.原理脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。 雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)和物，此反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)） 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（ CONH），與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)其吸光度，確定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化

19、2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。 3.主要儀器： 分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000 r/m in） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 甘油作為穩(wěn)定劑：取10ml10mol/L KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入50ml4%CuSO4。酒石酸鈉作穩(wěn)定劑，吸10ml10mol/L KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時(shí)慢慢加入4%CuSO4液40ml。 配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無(wú)氫氧化銅生成，否則

20、重配。(2) 四氯化碳5操作方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱0.6g樣品使用試劑準(zhǔn)確稱0.5g樣品使用試劑假如用試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品為標(biāo)樣，根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)含量，取離心澄清液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中分別加水定容，在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。 以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以上述吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）準(zhǔn)確稱樣0.5g于80ml離心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑蓋上蓋子離心10min（4000轉(zhuǎn)/分）放置1小時(shí)吸混合液15ml于20ml離心管中離心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于560nm

21、處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)含量。4 計(jì)算：蛋白質(zhì)%=（C/W）100 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得蛋白質(zhì)含量（mg） W-測(cè)定樣液時(shí)相當(dāng)于樣品重量（mg）三紫外吸收法 1原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，R（ NHCHCO-）在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質(zhì)濃度（38mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并參照事先用凱氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3主要儀器： 紫外分光光度計(jì) 離心機(jī)（3000 5000 r/min）4操作：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的

22、繪制：準(zhǔn)確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中，以每分鐘30005000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸取上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶鐘，每個(gè)容量瓶各加入8mol/l脲的氫氧化鈉溶液至標(biāo)線，充分搖2分鐘（如果混濁再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。（做參比值） 以事先用凱氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，上述的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取試樣1.00g于50ml燒杯中加0.1mol/l檸檬酸溶

23、液30ml攪拌10分鐘四層紗布過(guò)濾到離心管中用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白質(zhì)的含量。計(jì)算： 蛋白質(zhì)= （C/W）100 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（mg） W-測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（mg） 說(shuō)明：a.此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性蛋白質(zhì)樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。b.溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在2030。染料結(jié)合法：原理：在特定的條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料定量的反應(yīng)生成沉淀，用分光光度計(jì)測(cè)定沉淀反應(yīng)完全后剩余的染料量可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量，進(jìn)而求得樣品中蛋白質(zhì)的含量。適用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力飲料等食品

24、。四.水揚(yáng)酸比色法：1.原理： 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有藍(lán)色的化合物，可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。2.方法 （）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6 分別加空白酸液 2ml 分別加磷酸鹽緩沖液 5ml 稀釋至總體體積至 15ml 分別加水揚(yáng)酸鈉 5ml 37C水浴 15分鐘 加入次氯酸鈉 2.5ml 37C水浴 15分鐘 取出加水至標(biāo)線，于660nm下進(jìn)行比色測(cè)定，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線 （2）樣品處理： 準(zhǔn)確稱樣0.201.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g

25、催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化直到出現(xiàn)暗綠色時(shí)搖動(dòng)瓶子K氏瓶全部消化后冷卻加水至250ml容量瓶。（3）樣品測(cè)定： 準(zhǔn)確吸取上述消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容準(zhǔn)確吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸緩沖液以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同 并以試劑空白微對(duì)照，測(cè)得樣液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。（4）計(jì)算 CF含氮%= - 100 W10001000 C-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定樣液的含氮量（g） F-樣品溶液的稀釋倍數(shù) W-樣品重量（g） 蛋白質(zhì)%=總氮%K（K可為6.25，也可查）氨基酸的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法茚三酮顯色法氨基酸的分離及測(cè)定 蛋白質(zhì)可以被酶、酸或

26、堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能，常會(huì)因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過(guò)補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。 氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品的質(zhì)量指標(biāo)，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指標(biāo)之一，其中的含氮量可直接測(cè)定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。氨基酸態(tài)氮反映的是樣品中游離氨基酸的總量。氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法雙指示劑甲醛滴定法原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。

27、這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH基，用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。方法特點(diǎn)及應(yīng)用 此法簡(jiǎn)單易行、快速方便。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高；酪氨酸含有羥基，滴定時(shí)會(huì)消耗堿液使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果高。 特別適合淺色樣品的測(cè)定試劑 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液 0.1%中性紅50%乙醇溶液 0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液操作方法預(yù)處理：移取含氨基酸約2030mg的樣品溶液2份中和游離酸（用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它游離酸的含量）：其中1份加入3滴中性紅指示劑，用0.

28、1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅變?yōu)?琥珀 色為終點(diǎn)，記錄V1滴定氨態(tài)氮（用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基酸和游離酸的總含量）： 另1份加入3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)，記錄V2式中 c 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L; V1用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL; V2用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL; m測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol 結(jié)果計(jì)算 說(shuō)明及注意事項(xiàng)1、此法適用于測(cè)定食品中游離的氨基酸2、固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確

29、稱取后用水萃 取， 50水浴中萃取0.5h即可。液體樣品可直接進(jìn)行測(cè)定。3、若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測(cè)定，或用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。4、與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和-COOH 時(shí)的pH為8.59.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。電位滴定法原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)插入反應(yīng)體系中，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。儀器： 酸度計(jì)、磁力攪拌器、堿式滴定管25mL 刻度吸管：10mL 試劑：酚酞乙醇指示液：1%甲醛：36%-38%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：

30、0.05mol/L（標(biāo)定） 試驗(yàn)步驟 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL于燒杯中，加60mL水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V，可計(jì)算總酸含量）。 加入10mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V1。 同時(shí)取80mL水，先用0.05mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至p

31、H9.2，做試劑空白試驗(yàn)，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V2 。第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的NaOH溶液體積不用于計(jì)算氨基酸態(tài)氮，但可計(jì)算總酸含量）。第二次滴定才是測(cè)定氨基酸，用消耗的NaOH溶液體積進(jìn)行計(jì)算。在測(cè)定過(guò)程中加入中性甲醛的作用是什么？式中 W-氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，%; c-氫氧化鈉濃度，mol/L； V1-加入甲醛后耗NaOH的量，mL； V2-空白試驗(yàn)加甲醛后耗NaOH量，mL； 0.014-氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mol； m-樣品量，g說(shuō)明本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測(cè)定對(duì)于混濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定。結(jié)果要求精密度10% ，即

32、在重復(fù)條件下兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的10%。平行實(shí)驗(yàn)與結(jié)果處理平行實(shí)驗(yàn)是指在相同條件下同時(shí)做兩份測(cè)定.精密度是指同一樣品的各測(cè)定值的符合程度。如果兩份之間相對(duì)誤差不超過(guò)允許范圍,說(shuō)明該樣品的測(cè)定在精密度方面是可靠的;如果相對(duì)誤差超過(guò)允許范圍,則應(yīng)重做。在食品檢驗(yàn)中,如果相對(duì)誤差沒(méi)有特殊規(guī)定,相對(duì)誤差的允許范圍一般20%,其計(jì)算方法如下: 相對(duì)誤差(%)= 式中:A、B為兩次平行測(cè)定的結(jié)果。茚三酮顯色法原理：水合茚三酮與氨基酸反應(yīng)，水合茚三酮被還原成還原型水合茚三酮，氨基酸被氧化脫羧，產(chǎn)生醛、二氧化碳和氨。氨與水合茚三酮、還原型水合茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物(除脯氨酸外均有此

33、反應(yīng))，該化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。在570nm處測(cè)吸光度，用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液需澄清，通常采用活性炭脫色處理。氨基酸的分離及測(cè)定通常采用：氨基酸自動(dòng)分析儀氣相色譜法液相色譜法氨基酸自動(dòng)分析儀分析食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。一份水解液可同時(shí)測(cè)定天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴和精氨酸等16種氨基酸，其最低檢出限為10pmol。操作步驟樣品處理：樣品采集后用勻漿機(jī)打成勻漿（或者將樣品盡量粉碎）于低溫冰箱中冷凍保存，分析用時(shí)將其解凍后

34、使用。稱樣：準(zhǔn)確稱取一定量樣品，精確到0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋白質(zhì)含量在1020mg范圍內(nèi)；均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當(dāng)增大稱樣量，測(cè)定前再稀釋。將稱好的樣品放于水解管中。水解：在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸1015mL（視樣品蛋白質(zhì)含量而定），含水量高的樣品（如牛奶）可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚34 滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍35min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0psi），然后充入高純氮?dú)猓辉俪檎婵粘涞獨(dú)?，重?fù)三次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在1101的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。打開水解管，將水

35、解液過(guò)濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容。吸取濾液1mL于5mL容量瓶?jī)?nèi)，用真空干燥器在4050干燥，殘留物用 12mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，最后蒸干，用1mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測(cè)定用。測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.200mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH2.2的緩沖液稀釋到5mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋濃度為5.00 nmol/50L，作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測(cè)定氨基酸含量。緩沖液泵顯色反應(yīng)管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源食物中胱氨酸的測(cè)定方法-氨基酸自動(dòng)分析儀法（過(guò)甲酸氧化）原理在用鹽酸水解

36、蛋白質(zhì)的過(guò)程中，胱氨酸易被破壞，現(xiàn)多采用過(guò)甲酸氧化法將蛋白質(zhì)中的胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反應(yīng)如下： 半胱氨酸過(guò)甲酸 半胱磺酸甲酸生成的半胱磺酸可在氨基酸自動(dòng)分析儀上進(jìn)行測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)半胱磺酸比較，計(jì)算其含量。氣相色譜法1. The analysing principle of the GC2.The application of GC in the determination of amino acid液相色譜法食物中色氨酸的測(cè)定-熒光分光光度法原理食物中蛋白質(zhì)在酸水解過(guò)程中，其色氨酸極易被分解，本法用堿水解蛋白質(zhì)，直接測(cè)定色氨酸的天然熒光。在蛋白質(zhì)水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以檢測(cè)

37、到熒光。在pH為11時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度比酪氨酸大100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差40多nm，利用此特點(diǎn)，可在有大量酪氨酸的存在下，檢測(cè)色氨酸的含量。熒光分光光度計(jì)簡(jiǎn)介熒光分光光度計(jì)能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個(gè)角度反映分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍一般是190 650nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍是200800nm?？捎糜谝后w、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn)?；窘Y(jié)構(gòu)與原理由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激

38、發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過(guò)濾過(guò)和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來(lái)。基本結(jié)構(gòu)和原理如圖所示，光源與檢測(cè)器成直角方式安排。入射到樣品池的激發(fā)光和射向熒光單色器的熒光方向成直角，是為避免雜光和激發(fā)光進(jìn)入熒光單色器。思考題：1、蛋白質(zhì)系數(shù)是如何計(jì)算出來(lái)的？蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果為什么要乘以蛋白質(zhì)系數(shù)？2、為什么說(shuō)用凱氏定氮法測(cè)出的是粗蛋白的含量？ 薄層色譜法（薄層層析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography簡(jiǎn)介： 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來(lái)分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨