微生物檢驗教學課件（揚州大學）第九節(jié) 肉毒梭菌檢驗

1、第九節(jié) 肉毒梭菌檢驗Clostridium botulinum肉毒梭菌在嚴格厭氧的條件下可產(chǎn)生極其強烈的外毒素。該毒素性質(zhì)穩(wěn)定，不易被蛋白酶及酸破壞，人、畜多因食入此毒素的食品或飼料，而引起食物中毒。1958年新疆發(fā)生發(fā)酵性豆制品食物中毒，首次證實了肉毒梭菌在我國的存在。在新疆、青海、寧夏和四川等多發(fā)地區(qū)的土壤中，該菌的檢出率為，發(fā)酵食品中檢出率為。 肉毒毒素也有神奇的一面呦！2007年9月15日 消息(午夜新聞)：衛(wèi)生部14號晚發(fā)出緊急通知：警惕肉毒梭菌食物中毒事件。經(jīng)調(diào)查，在石家莊市乾豐食品、石家莊市東光食品廠、石家莊市獨一家食品、定州市新宗食品、饒陽縣健民食品廠生產(chǎn)的火腿腸中檢測出肉毒毒

2、素。河北省、山西省近日發(fā)生的肉毒梭菌食物中毒事件與這些產(chǎn)品有關。引起肉毒中毒的食品大致類型我國主要是家庭自制的發(fā)酵食品，如豆瓣醬、豆?jié){、臭豆腐等。少數(shù)發(fā)生于各種不新鮮肉、蛋、魚類食品。日本以魚類制品引起中毒者較多。美國 以家庭自制罐頭和肉乳制品引起中毒者為多。歐洲 多見于臘腸、火腿和保藏的肉類。致病性厭氧條件下可分泌強烈的外毒素肉毒毒素。毒力是目前生物毒素中最強的一種，毒性比氰化鉀強1萬倍1mg可致死2000萬只小白鼠，人的致死量為1g左右；蛋白質(zhì)，不耐熱，對酸性及蛋白酶抵抗力較強pH36時毒性仍保持穩(wěn)定，不被胃腸液破壞，毒素被人、畜、禽食入后即可發(fā)病，出現(xiàn)特征性的神經(jīng)中毒病癥，引起軟癱和麻痹

3、，嘔吐腹瀉。肉毒毒素C型肉毒中毒多見于雞及野禽，特別是水禽，且多因吃腐爛植物引起。D性肉毒中毒多見于南非及美國得克薩斯州的牛有異癖者，常因吃已死動物的骨骼動物死尸內(nèi)曾有肉毒梭菌繁殖。此外，C、D型還見于馬、綿羊、水貂飼料中毒。其中A、B、E、F型肉毒梭菌中毒大多數(shù)報道見于食用發(fā)酵的豆類、肉及肉制品、魚罐頭、魚罐頭及生魚等。中毒機理毒素經(jīng)胃腸道進入血液，作用于神經(jīng)及神經(jīng)-肌肉接頭處，以及植物神經(jīng)末梢。阻礙了乙酰膽堿的釋放，因而引起膽堿能神經(jīng)支配的肌肉和骨骼肌麻痹，產(chǎn)生病癥及死亡。根據(jù)肉毒毒素的抗原性，可將肉毒梭菌分為： A、B、C、D、E、F、G等7個型，其中C型還可分為C和C兩個亞型。微生物學

4、檢驗肉毒梭菌中毒為毒素中毒，故從患者體內(nèi)或殘留食物中查出肉毒毒素是最有價值的，而肉毒梭菌的別離培養(yǎng)僅作為診斷的輔助手段。對毒素的檢測以動物試驗方法開始較早，多種動物對肉毒毒素均很敏感，其中價格低廉且敏感性最高的是小白鼠。檢樣食品毒素檢測增菌、產(chǎn)毒培養(yǎng)，30，5day報告一毒素檢測報告二觀察生長性狀、染色特性別離培養(yǎng)觀察菌落性狀、染色鏡檢增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)，30，5day毒素檢測培養(yǎng)檢查報告三肉毒毒素檢測明膠磷酸鹽緩沖液成分明膠 2g磷酸氫二鈉 4g蒸餾水 1000ml液狀檢樣可直接離心，固體或半固體檢樣須加適當明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后離心，取上清液進行檢測。另取一局部上清液，調(diào)，每9份加1

5、0%胰酶活力1：250水溶液1份，混勻，不斷輕輕攪動，37作用60min，進行檢測。檢出試驗取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠三只，每只，觀察4天。注射液中假設有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在24h內(nèi)發(fā)病、死亡。主要病癥為豎毛、四肢癱瘓，呼吸困難，呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛假設蜂腰，最終死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以及病癥不明顯時，那么可將注射液做適當稀釋，重做試驗。確證試驗不管上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成三份進行試驗。一份加等量多型混合肉毒毒素抗診斷血清，混勻，37，作用30min。 一份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min。三份混合樣分別注射

6、小白鼠各兩只，每只，觀察4天，假設注射加診斷血清與煮沸加熱的兩組混合物的小白鼠均獲保護存活，而注射未經(jīng)其它處理的混合液的小白鼠以特有的病癥死亡，那么可判定檢樣中的肉毒毒素存在。定型試驗按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10 MLD/ml-1000 MLD/ml的范圍，分別與各單型肉毒毒素抗診斷血清等量混合，37，30min，各注射小鼠2只，每只，觀察4天。能保護動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清即為檢樣所含肉毒毒素的型別肉毒梭菌檢出取皰肉培養(yǎng)基三支，煮沸1015 min，做如下處理：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液12 ml冷卻至60 ，接種檢樣，繼續(xù)于60 保溫10

7、min，急速冷卻。接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10 min，急速冷卻。以上接種物30培養(yǎng)5天，假設無生長，可再培養(yǎng)10天。培養(yǎng)到期，假設有生長，取培養(yǎng)物離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，陽性結果證明檢樣中含有肉毒梭菌。肝塊肉湯成分牛肉膏 20g酵母浸膏 4g蛋白胨 4g磷酸氫二鈉 3g可溶性淀粉 1g蒸餾水 1000ml配制煮熟，過濾分裝。另將牛肉肝煮熟切成約34mm見方的小塊，每一試管放入35個小塊121，2030min滅菌別離培養(yǎng)選取經(jīng)毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物接種卵黃瓊脂平板，35 厭氧培養(yǎng)48 h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上時，菌落及周圍培養(yǎng)基外表覆蓋著特有的虹彩樣或珍珠層樣薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)跳取可疑菌落，接種皰肉培養(yǎng)基，于30培養(yǎng)5天，進行毒素檢測及培養(yǎng)特性確證試驗。預 防在食物原料保存運輸中防止污染。在制作過程中加溫要充分，足以殺滅肉毒梭菌芽孢。肉毒梭菌芽孢耐熱性強，但肉毒毒素并不耐熱，食物在食前，蒸煮3060分鐘，可以破壞毒素。對生產(chǎn)發(fā)酵食物、罐頭制品或腌制品的