常壓柱分離技術(shù)課件

1、第三章 常壓柱分離技術(shù) 一柱色譜分離技術(shù)分類二層析柱的制備三樣品的制備與上樣 四洗脫與分離五注意問(wèn)題 第1頁(yè)，共24頁(yè)。一柱色譜分離技術(shù)分類 柱色譜分離與薄層色譜類似，是靠洗脫劑把分離的各組分逐個(gè)洗脫下來(lái)的過(guò)程，故也稱洗脫色譜。 由于色譜柱填充的吸附劑的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于薄層板，因而柱色譜可用于分離量比較大（克數(shù)量級(jí)）的物質(zhì)，而薄層制備色譜分離量比較小，一般在毫克數(shù)量級(jí)。所以作為較大量制備分離，柱色譜優(yōu)于薄層色譜。 在柱色譜分離過(guò)程中,一般利用薄層色譜摸索柱色譜的分離條件; 利用薄層色譜鑒定、分析和分段收集洗脫出的洗脫液中的成分。第2頁(yè)，共24頁(yè)。 柱色譜分離技術(shù)按色譜原理 可分為下列類型：吸附柱色譜

2、分配色譜，離子交換色譜，分子排阻色譜 親和柱色譜，等。 第3頁(yè)，共24頁(yè)。 柱色譜分離原理 利用欲分離的混合物中各組分分配在吸附劑和洗脫劑之間，被吸附、分配、交換的性質(zhì)不同，而相互得以分離。 化合物被吸附、分配、交換的這種作用越強(qiáng)，該化合物溶解在洗脫劑中越少，沿洗脫劑移動(dòng)的距離則越小。反之，越多。 第4頁(yè)，共24頁(yè)。實(shí)驗(yàn)室常用的柱色譜有：以硅膠和氧化鋁為吸附劑的吸附柱色譜；以硅膠、纖維素和聚酰胺為載體（支持劑），以其吸收較大量的液體作為固定相的分配色譜（這里支持劑本身不起分離作用）。以葡聚糖凝膠為固定相的分子排阻柱色譜；以離子交換樹(shù)脂為固定相的離子交換柱色譜等。主要介紹以硅膠和氧化鋁等為吸附劑

3、的吸附柱色譜第5頁(yè)，共24頁(yè)。二層析柱的制備 色譜柱的大小，取決于被分離樣品的量和吸附劑的性質(zhì)，要根據(jù)實(shí)際應(yīng)用而定 1玻璃色譜柱 用前洗凈，干燥。柱子底鋪一層玻璃絲或者脫脂棉（有沙芯者可不用），然后放一層 (0.5-1cm)海沙（sea sand）（也稱石英沙）。 2裝柱 常壓柱層析裝柱方法有兩種(1) 干法裝柱(2) 濕法裝柱 第6頁(yè)，共24頁(yè)。 所用吸附固定相一般為硅膠，氧化鋁，粒度要求100-160目或160目以上。 吸附劑粒度越小，分離度越大，但洗脫速度，越慢。 Rf值相差較大時(shí)，應(yīng)用硅膠100-160目，可上樣30mg/g硅膠，更多的情況下硅膠量為10mg/g硅膠（即分離1g 樣品需

4、要100g 硅膠）。 應(yīng)用氧化鋁時(shí)，粒度要求100150目，分離1g樣品需要2050g氧化鋁。 第7頁(yè)，共24頁(yè)。(1) 干法裝柱 干法在柱子上端放一漏斗，直接加入硅膠，輕輕敲打?qū)游鲋?，或上下震?dòng)層析柱，使填裝均勻，再加一層海沙，然后加入洗脫劑，使硅膠潤(rùn)濕（溶劑化）. 必要時(shí)加壓或減壓以除去氣泡，加速溶劑化速度。溶劑化后的硅膠柱，均勻透明. 第8頁(yè)，共24頁(yè)。(2) 濕法裝柱 濕法將吸附劑硅膠與一定量溶劑調(diào)成懸漿狀，快速倒入柱管中，打開(kāi)活塞，使溶劑慢慢流出，吸附劑慢慢下降而均勻沉入色譜柱底。吸附劑填料完畢,一般在上面再覆蓋0.5cm厚的海沙。無(wú)論干法或濕法裝柱都要均勻，不能使柱子干了. 應(yīng)使溶

5、劑與海沙平面相齊。否則將會(huì)出現(xiàn)氣泡或裂縫。 第9頁(yè)，共24頁(yè)。三樣品的制備與上樣1被分離混合物為液體 將其中極性溶劑盡可能的用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除后，加入少許流動(dòng)相稀釋。 待將吸附劑上面的多余洗脫劑放出，直到柱內(nèi)液體表面降至吸附劑表面時(shí)，停止放出洗脫劑。 將樣品溶液用滴管或漏斗沿柱子內(nèi)壁直接加入柱中。樣品稀釋要盡可能用少的洗脫劑，然后用最少量洗脫劑洗滌器皿與層析柱內(nèi)壁，洗滌完畢，開(kāi)放活塞，使液體漸漸放出，液面降至吸附劑上端時(shí)，開(kāi)始加入流動(dòng)相洗脫。 第10頁(yè)，共24頁(yè)。2被分離混合物樣品為極性較小的固體 A. 盡可能使其溶于流動(dòng)相溶劑中。但應(yīng)注意，樣品在流動(dòng)相中的溶解度一般較小。如果樣品體積太大，分辨

6、能力就會(huì)降低。另一方面，如果樣品濃度過(guò)濃，就可能在柱頂部形成沉淀。B. 可選擇極性較小的溶劑溶解后上柱. 可選用的溶劑: CH2Cl2, CCl4, 甲苯，環(huán)己烷，石油醚。 總之溶劑極性不能比洗脫劑極性太大，否則將影響層析行為和分離效果或分不開(kāi)。極性小的溶劑一般指在溶劑極性順序中,極性小于二氯甲烷的溶劑; 另外溶劑量不能太多，以近飽和為宜。第11頁(yè)，共24頁(yè)。3被分離混合物樣品為難溶性固體a.可選擇極性大的溶劑溶解。如氯仿，丙酮，乙醇，甲醇，四氫呋喃，吡啶，免用DMSO, DMF沸點(diǎn)較高溶劑。b. 再加入適量的硅膠于溶劑中（一份樣品 + 約5份柱填料），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸去溶劑至干，讓樣品均勻

7、地涂布在固定相表面上，然后通過(guò)漏斗裝于柱子上端。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)，一定要加防爆球，以防樣品硅膠爆沸。 第12頁(yè)，共24頁(yè)。第13頁(yè)，共24頁(yè)。第14頁(yè)，共24頁(yè)。四洗脫與分離 1洗脫劑的選擇應(yīng)以TLC檢測(cè)為依據(jù)。被分離物質(zhì)的最佳 Rf值應(yīng)在0.2-0.5 內(nèi) 。被分離的2個(gè)點(diǎn)之間Rf值應(yīng)盡可能的大，越大越好。最小應(yīng)不小于 0.1。否則分離效果差或難以分離。2洗脫劑應(yīng)不斷加入，保持一定高度?；蚣右粌?chǔ)液燒瓶，以免流干。 第15頁(yè)，共24頁(yè)。第16頁(yè)，共24頁(yè)。3洗脫液收集 洗脫液采用等份法收集，例如5，10，20，30或50ml為一份。根據(jù)分離樣品多寡而定。用小試管或小容量瓶收集。4控制洗脫液流出速度。

8、不能太快，太快柱中交換來(lái)不及平衡，從而影響分離效果。一般以1-2滴/秒為宜。5洗脫液TLC檢測(cè)與合并。將每一個(gè)小容量瓶按編號(hào)點(diǎn)樣展開(kāi)，將Rf值相同者合并，濃縮-蒸干，最后進(jìn)一步純化（蒸餾或重結(jié)晶等）。 第17頁(yè)，共24頁(yè)。第18頁(yè)，共24頁(yè)。五注意問(wèn)題 1吸附劑表面加入海沙的目的是使加料時(shí)不致把吸附劑沖起，影響分離效果。若無(wú)沙子，也可用玻璃纖維。2層析法中最關(guān)鍵性的操作之一就是裝柱（向柱內(nèi)充填吸附樹(shù)）操作。固體吸附劑如硅膠、氧能鋁等柱填充料，柱子在充填時(shí)必須裝得非常均勻，決不可裝得不整齊、出現(xiàn)空氣泡、存在隙縫等。因?yàn)橐粋€(gè)化合物沿著柱子下行時(shí)，這些情況可能會(huì)出現(xiàn)在前沿域譜帶的異常。 第19頁(yè)，共24頁(yè)。（1）化合物譜帶的最前面的邊緣或稱前沿應(yīng)是水平的，或者說(shuō)應(yīng)是垂于柱的長(zhǎng)軸的。如果填充料填充不水平，或柱子末被夾持在兩個(gè)平面中(即前后，左右兩個(gè)平面)完全垂直的位置，第二條譜帶的最前面的邊緣在第一條譜帶洗脫完畢之前就將開(kāi)始洗脫出來(lái)了那么想分離每一組分是不可能的。 第20頁(yè)，共24頁(yè)。第21頁(yè)，共24頁(yè)。（2）若吸附劑表面有任何不平整性，或在填充料中