pcr技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用課件

1、第八章 PCR及其在食品中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)基因食品二. PCR技術(shù)三.PCR在食品中的應(yīng)用2022/7/23你吃過轉(zhuǎn)基因食品嗎？不管您愿不愿意，您己經(jīng)或正在把轉(zhuǎn)基因食品吃進(jìn)肚里2022/7/23轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)走進(jìn)我國百姓的生活。國內(nèi)尚沒有轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模生產(chǎn)近幾年我國大量從美國、阿根廷等國進(jìn)口大豆，其中大部分是轉(zhuǎn)基因大豆。我國有一半以上的大豆色拉油含有轉(zhuǎn)基因成分。2022/7/23究竟什么是轉(zhuǎn)基因食品？轉(zhuǎn)基因食品是否安全？它是否存在長期的隱患？2022/7/23主要內(nèi)容定義發(fā)展應(yīng)用安全性評價一. 轉(zhuǎn)基因食品2022/7/23What is Genetically Modified？什么是轉(zhuǎn)基因？

2、將不同來源的DNA分子進(jìn)行重組，克服了天然物種生殖隔離的屏障，將具有某種特性的基因分離和克隆，再轉(zhuǎn)接到另外的生物細(xì)胞內(nèi)。從而可以按照人們的意愿創(chuàng)造出自然界中原來并不存在的新的生物功能和類型。2022/7/23“轉(zhuǎn)基因生物”（ Genetically Modified Organisms）是指遺傳物質(zhì)基因被改變的生物，其基因改變的方式是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而不是以自然增殖或自然重組的方式產(chǎn)生。簡稱：GMOs2022/7/23轉(zhuǎn)基因生物的種類？目前已經(jīng)進(jìn)入食品領(lǐng)域的三類轉(zhuǎn)基因生物包括： 轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因植物（最多，最重要） 轉(zhuǎn)基因微生物 2022/7/23現(xiàn)在國內(nèi)都有哪些轉(zhuǎn)基因食品？第一批列入目錄的

3、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物是：大豆：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕玉米：玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉油菜：油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕棉花種子番茄：番茄種子、鮮番茄、番茄醬2022/7/23“轉(zhuǎn)基因食品”（Genetically Modified Foods)是指用轉(zhuǎn)基因生物制造、生產(chǎn)的食品、食品原料及食品添加物等。簡稱：GMF2022/7/23為什么會對轉(zhuǎn)基因食品有恐懼心理？據(jù)專家分析，轉(zhuǎn)基因食品在基因重組與改變過程中，可能產(chǎn)生某種毒性、過敏性，生成抗?fàn)I養(yǎng)因子。引起營養(yǎng)成分改變，或者某種抗抗生素基因隨食品轉(zhuǎn)移到腸道，使抗生素對該機(jī)體從此失去療效。就目前而言，還沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品對人類有害

4、，但同時也缺乏證據(jù)證明它的無害性，因此產(chǎn)生了一些爭論。2022/7/23從本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因生物和常規(guī)育種的品種是一樣的兩者都是在原有的基礎(chǔ)上對某些性狀進(jìn)行修飾，或增加新性狀、或消除原有不利性狀。有意識的雜交育種已有100多年的歷史2022/7/23轉(zhuǎn)基因植物的安全性爭論支持派認(rèn)為：如果轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)生物技術(shù)得不到社會支持，這一研究將被扼殺，并且強(qiáng)調(diào)，迄今為止并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品危害人體健康和環(huán)境的確切證據(jù)。2022/7/23美國人食用轉(zhuǎn)基因食品已多年，超級市場上有4000多種商品是含有轉(zhuǎn)基因植物成分的，還沒有事例證明人吃了以后會得病，甚至?xí)鹚劳?。加拿大、澳大利亞也是轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)大國，均有幾

5、千萬人在吃，到現(xiàn)在為止也沒有個案例說明它有問題 。2022/7/23反對派的觀點一英國科學(xué)家聲稱，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯會減弱老鼠免疫系統(tǒng)功能；美國康乃爾大學(xué)也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因玉米會危害蝴蝶幼蟲及其相關(guān)生態(tài)環(huán)境。2022/7/23環(huán)保團(tuán)體認(rèn)為這種違反自然的轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品，未經(jīng)長期安全測試，長期食用可能對人類及生態(tài)環(huán)境造成負(fù)面影響。尤其是注重環(huán)境和生態(tài)保護(hù)的歐盟國家，對轉(zhuǎn)基因作物更加排斥，因而抵制美國GMO產(chǎn)品的進(jìn)口。2022/7/23基 因 工 程 的 特 點改良和培育新產(chǎn)品，促進(jìn)快速生長，縮短育種年限提高產(chǎn)量和質(zhì)量，增強(qiáng)抗逆性(抗旱、寒、澇、熱、病毒和蟲害等)，大大降低成本，產(chǎn)出口味更佳的食物。2022

6、/7/23二. PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史 PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用2022/7/23PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長2022/7/23PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶R

7、NA引物RNA引物2022/7/23PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶2022/7/23PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序

8、和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了2022/7/23PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎2022/7/23Kary B. Mullis

9、 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。2022/7/23PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。2022/7/23Target SequenceTarget SequencePCR原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使

10、模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2022/7/23PCR Cycle 第二步 Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；2022/7/23PCR Cycle 第三步 Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在T

11、aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。2022/7/23End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。2022/7/23Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,

12、073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon2022/7/23PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：10X緩沖液 10 L4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L2022/7/23PCR儀2022

13、/7/23PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA2022/7/231）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)體系2022/7

14、/23（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。2022/7/23（4）dNTP(脫氧核苷三磷酸) dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。2022/7/23（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg

15、2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2022/7/23PCR技術(shù)的主要類型反向PCR 錨定PCR不對稱PCR 原位PCRRT-PCR 重組PCR差異顯示PCR免疫PCR實時定量PCR多重PCR2022/7/23三.PCR在食品中的應(yīng)用食品微生物檢測轉(zhuǎn)基因食品的檢測2022/7/23第八章 生物芯片及其在食品中的應(yīng)用一、生物芯片簡介二. 生物芯片在食品中的應(yīng)用2022/7/23一. 生物芯片簡介 美國科學(xué)雜志將生物芯片評選為1998 年世界科技十大突破之一。2

16、022/7/23生物芯片的發(fā)展歷程 各國企業(yè)與政府均瞄準(zhǔn)這一新興產(chǎn)業(yè)，紛紛 投入巨資建立研發(fā)機(jī)構(gòu)。 中國政府決定于2000、2001年在北京與上海分別建立生物芯片國家工程研究中心。 近年來美國FDA批準(zhǔn)了二款可以用于臨床檢測的芯片產(chǎn)品, 開始了生物芯片由研究市場向臨床診斷市場的轉(zhuǎn)變。2022/7/23 1996年至今，共有13,000 多篇微陣列芯片相關(guān)論文發(fā)表，其中1,000 多篇發(fā)表在Cell、Nature（及姊妹刊）、Science 等國際頂級學(xué)術(shù)刊物上。2022/7/231.1什么是生物芯片(Biochips)？ 生物芯片是將大量生物識別分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體（如硅片、玻片

17、及高聚物載體等）表面，利用生物分子的特異性親和反應(yīng)，如核酸雜交反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)等來分子各種生物分子存在的量的一種技術(shù)。 能對小分子、生物大分子、細(xì)胞和組織等進(jìn)行高通量快速、并行處理和分析的微型器件2022/7/231.2生物芯片的類型：生物芯片DNA芯片蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片其它芯片樣品制備芯片核酸擴(kuò)增芯片毛細(xì)管電泳芯片微縮芯片實驗室2022/7/23生物芯片的分類根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。2022/7/23 1. 載體: 生物芯片的固相支持基質(zhì).要求: a. 載體表面必須具

18、有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性物質(zhì) b. 使單位載體上結(jié)合的生物分子達(dá)到最佳容量。 c. 載體性能不會干擾生物分子的功能，具有足夠的穩(wěn)定性。 d. 有良好的生物兼容性. e. 具有良好的光學(xué)性質(zhì)，能適應(yīng)透射光或反射光的測量。1.3 生物芯片的制作2022/7/23生物芯片的制作載體的材料在制作生物芯片時，載體材料很多，大致可分為四類：1無機(jī)材料2天然有機(jī)聚合物3人工合成的有機(jī) 高分子聚合物4各種高分子聚合 物制成的各種膜2022/7/23載體的預(yù)處理1、實性材料支持物的預(yù)處理 硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝膠、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。 預(yù)處理： 表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)。這些基團(tuán)在合成前用光敏保護(hù)基保護(hù)起來。 氨基硅烷化或包被多聚賴氨酸。 2022/7/232、膜性材