細胞凋亡的研究方法的建立與評價課件

1、Apoptosis 細胞凋亡研究方法建立與評價蔣紀愷研究生？研究方向研究立題（研究背景、發(fā)現(xiàn)問題、提出問題（？）、提出假設、解決問題的策略與方法） 申請課題，獲得經(jīng)費實驗驗證（實驗模型、技術(shù)指標、方法建立與評價）結(jié)果分析（撰寫論文，申報專利，評獎）研究方向：白血病研究立題：腫瘤靶向治療的分子機制研究。文獻 閱讀與學習。信號轉(zhuǎn)導在白血病發(fā)生 與治療的背景知識 研究模型：白血病細胞株；動物模型等技術(shù)平臺：實驗技術(shù)的建立與評價，（技術(shù)指 標，動手能力） 結(jié)果分析：統(tǒng)計學知識，文獻回顧論文撰寫：語言能力研究背景腫瘤治療手術(shù)放療化療骨髓移植（白血病） 增殖 分化 凋亡 Survival Growth D

2、ifferetiation Apoptosis 腫瘤 Tumour立題依據(jù)增殖：細胞通過分裂使細胞數(shù)目增加的過程 ，細胞分裂。（真核細胞的增殖方式有：有絲分裂、減數(shù)分裂、無絲分裂三種方式，只有連續(xù)進行有絲分裂的細胞才具有細胞周期。 ）分化：在個體發(fā)育中，通過細胞分裂后產(chǎn)生的子代細胞比上一代細胞具有更專一的功能。后代在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性的差異過程稱為細胞分化（cellular differentiation）。（比如血液中的紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板等都是從造血干細胞分化出來的，但是與造血干細胞相比，這些子代細胞都具有更加專一的功能。 ）凋亡：細胞凋亡指的細胞的程序性死亡，細胞被自

3、身的酶降解，按一定的步驟“自殺”，其死亡細胞仍為一整體，最終被白細胞吞噬。（而細胞壞死會有細胞壁破裂的現(xiàn)象，內(nèi)含物外泄，會影響周圍的細胞。）啟動 凋亡早期 凋亡中期 凋亡晚期 Caspase 激活核染色質(zhì)凝縮 細胞膜PS 外翻線粒體膜電位喪失DNA 被切割成片段凋亡小體形成信號通路研究模型慢性粒細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML ） 逆轉(zhuǎn)K562 cell line 分化（紅系細胞） 增殖 凋亡 藥物誘導Leukemia cell linesK562 cellsa bcr:abl positive erythroleukamia line derive

4、d from a 53 year old female CML patient in blast crisisPhiladelphia chromosomeLeukemia cell linesHL60(Human promyelocytic leukemia cells)derived from a 36-year-old woman with acute promyelocytic leukemia at the National Cancer Institute研究方法建立與評價靈敏度特異性蛋白質(zhì)分析1，染色2，酶3，免疫分泌蛋白、膜蛋白、細胞質(zhì)，細胞核蛋白方法學建立與研究策略藥物濃度的

5、選擇（MTT）形態(tài)學觀察（凋亡小體形成）DNA 被切割成片段細胞膜PS 外翻Caspase 激活信號通路MTT測定細胞增殖MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）是Mosmann1983年報告的。原理是活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物（MTT）由黃色還原為紫紅（蘭）色的甲（肷）紫,后者溶于有機溶劑（如二甲基亞楓、酸化異丙醇等）,甲紫（肷）產(chǎn)量與細胞活性成正比?？稍?60nm處用酶標儀測定其OD值。 形態(tài)學觀察DNA 被切割成片段Annexin V基本原理細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露

6、在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以