液相色譜培訓講義課件

1、液相色譜培訓講義北京東西分析儀器有限公司主要內容高效液相色譜的基礎知識高效液相色譜系統(tǒng)固定相和流動相LC-5500的使用、維護及應用液相色譜分析中的樣品前處理高效液相色譜的基礎知識液相色譜培訓（一）色譜色譜法 又叫色層法、層析法，其本質是一種分離分析方法 色譜法是利用混合物中各組分在兩相間分布系數(shù)的差異，在兩相相對移動過程中，各物質在兩相間反復多次分配，從而使各組分得到分離的方法色譜 目前最有效的分離方法色譜的分類按流動相的物態(tài)分: 氣相色譜(Gas Chromatography, GC) 用氣體作為流動相(又叫載氣) 液相色譜(Liquid Chromatography, LC) 用液體作為

2、流動相(又叫洗脫劑)液相色譜發(fā)展簡史1903年：俄國植物學家Tswett提出了應用吸附學原理分離植物色素的新方法，標志這現(xiàn)代色譜學的開始1931年：Kuhn等以粉碎的碳酸鈣裝填色譜柱，成功地從蛋黃中分離出植物葉黃素，也證實了色譜法可以用于制備分離1941年：Martin等采用水分飽和的硅膠為固定相，以含乙醇的氯仿為流動相，分離了乙酰基氨基酸，這是分配色譜的首次應用20世紀60年代：高效液相色譜得到普及應用1975年：美國Dow Chemical公司Small等研制成功了采用電導檢測器的高效液相色譜儀，這種方法稱為離子色譜法（IC），擴展了高效液相色譜的領域。近年來：超高壓液相色譜（UPLC）問

3、世，使得液相色譜應用領域更加廣泛茨維特實驗的原形1903年Tswett用右邊圖示的實驗裝置，使用液體淋洗的辦法實現(xiàn)了多種物質的分離從而確立了色譜分析法。從此這個實驗方法就成為： 經(jīng)典液相色譜法 時至今日這種方法還被廣泛地應用著隨著科學技術的發(fā)展，科學工作者改進了液相色譜柱的填料，從而就出現(xiàn)了高效液相色譜分析。幾種英文縮寫的解釋：HPLCHigh Performance Liquid ChromatographyHPLCHigh Pressure Liquid Chromatography高效液相色譜 HPLC (High Performance Liquid Chromatography )以

4、氣相色譜為基礎，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術基礎上建立的一種液相色譜法。是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段： o高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈敏度檢測器 廣泛應用于各個領域: o醫(yī)藥，環(huán)保，石化，生命科學，食品工業(yè)，農業(yè)HPLC的分離原理高效液相色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相(stationary phase)時，由于與固定相發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、離子交換、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。流動相色譜分離樣品的過程HPLC的特點“三高” “一快” “一廣”高柱效高靈敏度高選擇

5、性分析速度快應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測 主要差別：分析對象的差別和流動相的差別分析對象 GC：可分析能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品 HPLC：可分析溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性 差及高分子和離子型樣品均可檢測流動相 GC：流動相為氣體 HPLC：流動相為液體 HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別經(jīng)典LCHPLC色譜柱：柱長10200cm，內徑1050mm色譜柱：柱長1025cm，內徑210mm常壓或減壓高壓，4050MPa填料顆粒大，75600m（20030目）填料顆粒小，25

6、0m（2500300目）柱效低，2050塊/m柱效高，4000060000塊/m分析速度慢，120h分析速度快，0.051.0h色譜柱只用一次色譜柱可重復多次使用不能在線檢測能在線檢測基本概念和術語色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)-樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)?；€(base line)-經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。噪音(noise)-基線信號的波動。漂移(drift)-基線隨時間的緩緩變化。色譜峰(peak)-組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線

7、。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。檢測器響應保留時間和峰形檢測器響應保留時間和峰形檢測器響應保留時間和峰形色譜圖基底基線色譜峰峰面積峰高拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。中國藥典規(guī)定T應為0.951.05。T0.95為前延峰，T1.05為拖尾峰。峰底基線上峰的起點至終點的距離。峰高(peak height，h)-峰的

8、最高點至峰底的距離。標準偏差（standard deviation，)-正態(tài)分布曲線x1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰寬（peak width，W)-峰兩側拐點處所作兩條切線與峰底的兩個交點間的距離。W4半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/22.355峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積?；靖拍詈托g語基本概念和術語定性參數(shù)（保留值）死時間(dead time，t0)

9、-不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。死體積(dead volume，V0)-由進樣器進樣口到檢測器流通池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流通池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0Ft0（F為流速）保留時間(retention time，tR)-從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。保留體積(retention volume，VR)-從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃

10、度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VRFtR柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)-用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。 N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以

11、上。）若用調整保留時間(tR)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效)。理論塔板高度(theoretical plate height，H)-每單位柱長的方差。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。基本概念和術語基本概念和術語相平衡參數(shù)分配系數(shù)(distribution coefficient，K)-在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。即， K = Cs / Cm 分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))， 凝膠色

12、譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。 在條件(流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的

13、前提。在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的?；靖拍詈托g語容量因子(capacity factor，k)-化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。因此容量因子也稱質量分配系數(shù)。 容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（tR）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k0時， 化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留， tR 0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。 容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性

14、質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于tR 、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應用更廣泛。選擇性因子(selectivity factor，)-相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。又稱為相對保留時間（美國藥典）。 要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異?；靖拍詈托g語分離參數(shù)分離度(resolution，R)-相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的

15、分離程度。當W1W2時，R1。當R1時，稱為4分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內側峰基重疊約2%。R1.5時，稱為6分離，裸露峰面積為99.7%。R1.5稱為完全分離。 中國藥典規(guī)定R應大于1.5。 提高分離度有三種途徑：增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加選擇性。當1時，R0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值； b. 改變柱溫； c. 改變固定相。改變容量因子。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k趨于0時，R也趨于0；

16、k增大，R也增大。但k不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k在110范圍內，最好為25，窄徑柱可更小些。R = 1R = 1.5色譜分離的理論 色譜理論有平衡色譜理論；塔板理論；速率理論等理論。下面對塔板理論和速率理論作簡單的介紹。塔板理論(Tower plank Theories)塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為： 色譜柱內存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內完全服從分配定律，并很快達

17、到分配平衡。 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。 流動相在色譜柱內間歇式流動，每次進入一個塔板體積。 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關。雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。 理論塔板數(shù) 色譜柱效能 描述當溶質流經(jīng)色譜柱時譜帶展寬速率理論塔板等效高度有效理論塔板數(shù)塔板理論(Tower plank Theories)速率理論(Velocity Theories)1956年荷蘭學者Van De

18、emter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論速率理論。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響 速率理論(Velocity Theories)H = A + B/u + Cgu + CluHuB/uCuAu最佳A渦流擴散項B分子擴散項Cg固定相傳質阻抗Cl流動相傳質阻抗高效液相色譜的分類按色譜過程的分離機制，可將高效液相色譜分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對色譜和體積排阻色譜等類別根據(jù)流動相與固定相極性的差別，可分為正相色譜和反相色譜兩種模式。固定相極性大于流動相極性時，稱為正相色譜（N

19、P）；反之，稱為反相色譜（RP）正相高效液相色譜以極性的親水性填料作固定相（如羥基柱、氨基柱、氰基柱），以非極性的疏水性溶劑或混合物作流動相（如己烷）的高效液相色譜正相高效液相色譜的流動相：常用己烷，環(huán)己烷作基礎溶劑，加二氯甲烷、短鏈醇、四氫呋喃調節(jié)極性應用于分離中等極性和極性較強的化合物，如甾醇類、類脂化合物、磷脂化合物、脂肪酸及其它有機物反相高效液相色譜以強疏水性的填料作固定相（如硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相），以可以和水混溶的有機溶劑做流動相（如甲醇、乙腈）的高效液相色譜反相高效液相色譜的流動相：高純度的水，甲醇，乙腈，一定pH值的緩沖液應用十分廣泛，占高效液相色譜的70%

20、80%，從一般小分子有機物到藥物、農藥、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白質（50kD）的分析均可應用高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱儲液瓶色譜分離樣品的過程色 譜 柱檢測器色 譜 圖時刻A時刻B時刻C時刻D時刻E時刻F進樣色譜圖的作用 說明樣品中的組分數(shù) 根據(jù)保留時間值定性 根據(jù)峰面積（峰高）定量 評價柱效及分離情況定性和定量方法死時間t0，保留時間tR峰高h，峰面積A基線峰底色譜峰峰高峰面積利用保留值定性在液相色譜中，組分的保留行為不僅與固定相有關，還與流動相的種類、組成有關在液相色譜中主要是用與已知物對照的方法定性，改變條件進一步判斷利用文獻數(shù)據(jù)只能作為參考利用

21、三維圖譜進行定性，可靠性大大增加用保留時間定性的譜圖對比三聚氰胺標樣蛋白粉樣品定量方法峰高和峰面積法定量，主要有四種定量方法 歸一化法 內標法 外標法-標準曲線法 內加法外標法液相最常用的定量方法峰高法和峰面積法的選擇主要決定于檢測器的線性范圍、峰高和峰面積測量的準確性和重復性。歸一化法最好用峰面積法，其余方法峰高和峰面積都可使用分離度較好，色譜峰形較好，峰面積可以準確測量時，用峰面積定量為好，特別是HPLC使用多元梯度時，最好用峰面積定量分離度不好、色譜峰形不好時，用峰高法為好保留時間短的用峰高法，長的用峰面積法高效液相色譜系統(tǒng)液相色譜培訓（二）高效液相色譜流程圖高壓泵進樣器檢測器色譜工作站

22、色譜柱儲液瓶一個存放流動相的容器。其結構材料必須對流動相是化學惰性的，常用的溶劑儲液瓶的材料應耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料、特種塑料聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯襯里不銹鋼容器等，貯液罐容積一般為0.52 L 儲液瓶輸液系統(tǒng)功能：溶劑輸送目標：穩(wěn)定準確重要指標：耐壓能力壓力脈動流量精密度流量準確性高壓輸液泵柱雙柱塞往復式并聯(lián)泵柱雙柱塞往復式串聯(lián)泵進樣器自動進樣器和手動進樣器原理：六通閥手動進樣器六通閥一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊（轉子）和固定底座（定子）組成。耐高壓（3540MPa），進樣量準確，重復性

23、好，操作方便 分離系統(tǒng)功能：組分分離目標：分辨力強效率高色譜柱液相色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，是分析好壞、成敗的關鍵鍵合相色譜柱鍵合相:反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅膠、 -NH2、 -CN、-OH其它 (手性柱, 離子交換柱): 10%反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18 和 C8 在反相色譜中應用得最為廣泛。檢測器功能：檢測組分濃度目標：準確檢出限低重要指標：噪聲、漂移、線性、檢出限紫外檢測器（包括二極管陣列檢測器）熒光檢測器示差折光檢測器電導檢測器蒸發(fā)光散射檢測器原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選

24、擇性吸收定量基礎：朗伯-比耳定律，ACL優(yōu)點： 1）靈敏度高 2）對溫度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質紫外檢測器 樣品池二極管陣列光柵D2 / W 燈每一組分可在每一波長處得到一吸光度值二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗3）光譜庫檢索4）可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰二極管陣列檢測器的優(yōu)點大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度，所以紫外-可見檢測器可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中50%以上是紫外-可見檢測器，25%是PDA）紫外-可見檢測器原理：基于被分析組

25、分發(fā)射的熒光強度進行檢測優(yōu)點： 1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器之一 2）選擇性好 3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質可檢測物質：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）熒光檢測器原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。優(yōu)點：通用型檢測器，缺點：1）對溫度變化敏感2）對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測3）屬于中等靈敏度的檢測器示差折光檢測器原理：根據(jù)物質在某些介質中電離后所產(chǎn)生的電導變化來測定電離物質含量。廣泛應用于離子色譜法優(yōu)點：對流動相流速和壓力的改變不敏感，可用于梯度洗脫缺點：對溫度變化敏感（每升高1

26、度，電導率增加2%-2.5%)主要用于離子色譜檢測水溶性無機和有機離子電導檢測器蒸發(fā)激光光散射檢測器（ELSD）通用型檢測器（適合于揮發(fā)性比流動相低的任何組分）；響應值與組分質量有關；可用于梯度洗脫HPLC柱噴霧氣體蒸發(fā)漂移管激光光源樣品液滴光二極管檢測器散射室工作站數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)功能：采集處理數(shù)據(jù)目標：使用便捷功能完善梯度洗脫HPLC有等強度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式 等度洗脫是在同一分析周期內流動相組成保持恒定，適合于組分數(shù)目較少，性質差別不大的樣品 梯度洗脫是在一個分析周期內程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分數(shù)目多、性質差

27、異較大的復雜樣品 比例閥檢測器進樣器ABCD色譜柱高壓輸液泵低壓梯度阻尼器混合器高壓輸液泵檢測器進樣器色譜柱梯度混合器高壓輸液泵高壓梯度梯度洗脫梯度洗脫的特點優(yōu)點縮短分析時間增加分離能力提高檢測靈敏度缺點儀器設備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復性較低高效液相色譜的配件管路與連接件脫氣裝置：在線脫氣機或超聲波清洗器過濾器：溶劑過濾器和針筒式過濾器進樣器：平頭進樣器不同材質的管路不銹鋼管：耐腐蝕性好，有精密的同軸度，一般用于高壓部分聚合物管：用在液相色譜系統(tǒng)中從儲液瓶到泵、檢測器出口以后和進樣器排液口等低壓部分PEEK（聚醚醚酮）管：是一種耐高溫、高性能的工程塑料，具有良

28、好的惰性，適宜于生物樣品的分離分析液路連接件連接件也稱接頭一般可分為兩種：高壓接頭和低壓接頭 高壓接頭采用不銹鋼材質 低壓接頭采用高聚物材質連接件主要有卡套和空心螺釘液路連接密封示意圖 液路連接裝配不合適的示意圖脫氣裝置超聲波清洗器通過超聲波作用使流動相中的氣泡排除，超聲脫氣效率只有2030左右在線脫氣機脫氣效果好，脫氣效率大于70，在線脫氣機使用方便、省事，尤其是在作梯度洗脫時最好用在線脫氣機。過濾裝置溶劑過濾器為了除去流動相中的雜質，對流動相進行過濾溶劑過濾器要配濾膜（有機系和水系，規(guī)格0.45m或更小孔徑的濾膜）針筒式過濾器樣品溶液在進入色譜系統(tǒng)前必須經(jīng)過針筒式過濾器針筒式過濾器也分為有

29、機系和水系，規(guī)格0.45m或更小孔徑的進樣器液相色譜的進樣器必須是平頭進樣器常配的進樣器規(guī)格為10、25、50、100 L最常使用的為50 L的進樣器LC-5500和LC-5510高效液相色譜儀介紹LC-5500高效液相色譜儀LC-5500高壓輸液泵P-101型高壓液相平流泵由泵體、過濾器、緩沖器、步進電機、步進電機驅動器、控制電路板、鍵盤以及液晶顯示器等部件構成 LC-5500高壓輸液泵技術指標工作壓力：040MPa流量范圍：0.015.0mL/min流量穩(wěn)定性：1壓力脈動： 1LC-5500高壓輸液泵主要特點采用雙柱塞交替輸液吸液，特殊設計的非圓凸輪運動曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機及

30、電路設計，實現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過壓對色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來顯示泵的設置參數(shù)和運行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準確LC-5500高效液相色譜儀主機主機包括兩部分：柱溫箱紫外-可見光檢測器LC-5500柱溫箱技術指標：溫度控制范圍：室溫1080溫度控制精度：1功能特點：控溫精度準確更換色譜柱方便分析結果重現(xiàn)性好保證檢測穩(wěn)定性LC-5500紫外-可見光檢測器技術指標：波長范圍：190650nm波長精度: 2nm 波長重復性:優(yōu)于2nm基線噪聲：110-4AU基線漂移：510-4AU/h光譜帶寬：8nm流通池體積：5

31、ul最小檢測濃度：410-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5500紫外-可見光檢測器功能特點：使用波長范圍寬波長精度準確能夠實現(xiàn)多波長測定LC-5500工作站功能特點：具有儀器控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進行波長程序控制可設定柱溫可對兩臺泵進行程序控制，進行梯度洗脫 LC-5510高效液相色譜儀LC-5510 在線脫氣機在線脫氣機主要由真空泵、脫氣膜管、傳感器、控制電路、真空腔等組成在線脫氣機的主要目的是脫除流動相中的氣泡LC-5510高壓輸液泵技術指標工作壓力：042MPa流量范圍：0.015.0mL/min流量穩(wěn)定性：1壓力脈動： 1LC-5100高壓輸液泵主要特點采用雙柱塞交替輸

32、液吸液，特殊設計的非圓凸輪運動曲線，保證輸出液體流速穩(wěn)定精密電機及電路設計，實現(xiàn)流量控制和流速的穩(wěn)定性壓力傳感器避免了過壓對色譜柱和泵的意外損害性能良好的阻尼器有效消除了輸液脈沖采用LCD帶背光的顯示屏來顯示泵的設置參數(shù)和運行參數(shù)。梯度洗脫流量程序智能化，流量準確LC-5510柱溫箱技術指標：溫度控制范圍：580溫度控制精度：0.2溫度設定值誤差： 0.5LC-5510柱溫箱功能特點：控溫精度準確分析結果重現(xiàn)性好保證檢測穩(wěn)定性采用LCD帶背光的顯示屏來顯示柱溫的設置和運行溫度既可升溫也可降溫，能滿足一些特殊用戶的需求LC-5510紫外-可見光檢測器技術指標：波長范圍：190650nm波長精度:

33、 0.2nm 波長重復性:優(yōu)于0.2nm基線噪聲：610-5AU（動態(tài)，254nm）基線漂移：2.510-4AU/h（動態(tài)，254nm）光譜帶寬：8nm流通池體積：5ul最小檢測濃度：110-8g/mL (萘的甲醇溶液) LC-5510紫外-可見光檢測器功能特點：使用波長范圍寬波長精度高噪聲低漂移小可用汞燈自動校正波長采用LCD帶背光的顯示屏來顯示波長的設置參數(shù)和運行參數(shù)LC-5510工作站功能特點：具有色譜儀控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)；可進行波長程序控制可對兩臺泵進行程序控制，進行梯度洗脫功能健全，操作便捷 固定相和流動相液相色譜培訓（三）色譜柱色譜柱是高效液相色譜儀的核心部分，要求分離度

34、高，柱容量大，分析速度快。高性能的色譜柱與固定相本身性能、柱結構、填裝和使用技術等有關。液相色譜柱是分析好壞、成敗的關鍵，整個液相分析過程中，其作用的重要性猶如人的心臟色譜柱的分類按填料表面改性與否分為吸附型和化學鍵合型按照分離模式分為正相、反相、離子交換、疏水作用、體積排組、親和、手性等類型按照分離規(guī)模及色譜柱的幾何尺寸，可分為制備柱、分析柱、微型柱等類型色譜柱結構色譜柱的基質填料硅膠基質填料聚合物基質填料硅膠基質填料目前應用最為廣泛的基質填料高機械強度和高的比表面積可利用直接的廣泛的表面鍵合反應來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求重現(xiàn)性好pH 適用范圍為pH 28具

35、有容易導致強堿性物質拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基聚合物基質填料交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 穩(wěn)定性好：pH 113可以在很寬的范圍內進行表面化學處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求在中等 pH 條件下對強堿性物質具有更好的峰形。填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮分離效率相對硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好化學鍵合固定相將各種不同的有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，而生成化學鍵合固定相化學鍵合固定相對各種極性溶劑都有良好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性由化學鍵合固定相制備的色譜柱柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，幾乎對各種類型的

36、有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作 類 型性 質色譜分離方式應 用 范 圍烷基非極性反相、離子對中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質、甾族化合物（類固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類固醇）、PTH衍生花氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團，適用于分離酚類、芳硝基化合物，其保留行為比C18更強（k增大）二醇基弱極性正相

37、或反相二醇基團比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤濕，適于分離有機酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質的凝膠過濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類，甾類化合物，氯代農藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有機酸二胺基極性正相、陰離子交換

38、正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機酸化學鍵合固定相的類型及其應用范圍類 型性 質色譜分離方式應 用 范 圍烷基非極性反相、離子對中等極性化合物，溶于水的高極性化合物，如：小肽、蛋白質、甾族化合物（類固醇）、核堿、核苷酸、極性合成藥物等苯基非極性反相、離子對非極性至中等極性化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烴、酯類（鄰苯二甲酸酯）、脂溶性維生素、甾族化合物（類固醇）、PTH衍生化氨基酸酚基弱極性反相中等極性化合物，保留極性相似于C8固定相，但對多環(huán)芳烴、極性芳香族化合物、脂肪酸等具有不同的選擇性醚基弱極性反相或正相醚基具有斥電子基團，適用于分離酚類、芳硝基化合物，其保留行為比C18

39、更強（k增大）二醇基弱極性正相或反相二醇基團比未改性的硅膠具有更弱的極性，易用水潤濕，適于分離有機酸及其齊聚物，還可作為分離肽、蛋白質的凝膠過濾色譜固定相芳硝基弱極性正相或反相分離具有雙鍵的化合物，如芳香族化合物多環(huán)芳烴腈基極性正相（反相）正相相似于硅膠吸附劑，為氫鍵接受體，適于分析極性化合物，溶質保留值比硅膠柱低，反相可提供與C8、C18，苯基柱不同的選擇性胺基極性正相（反相、陰離子交換正相可分離極性化合物，如芳胺取代物，脂類，甾類化合物，氯代農藥；反相分離單糖、雙糖等碳水化合物；陰離子交換可分離酚、有機羧酸和核苷酸二甲胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離弱有

40、機酸二胺基極性正相、陰離子交換正相相似于胺基柱的分離性能；陰離子交換可分離有機酸 使用鍵合固定相應注意的問題（1）硅膠鍵合相的穩(wěn)定性 鍵合相的使用壽命取決于鍵合的有機官能團在硅膠表面的覆蓋程度，覆蓋量大或呈多分子 覆蓋層時會增加其穩(wěn)定性。通常正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相反相烷基鍵合相的 穩(wěn)定性與使用流動相的pH值有關，通常水溶液的pH應保持在28之間，pH8.5會引起基 體硅膠的溶解。（2）鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性 使用鍵合相時經(jīng)常會遇到，同一類型的鍵合相，因生產(chǎn)廠家不同，或生產(chǎn)批號不同，而表 現(xiàn)出不同的色譜分離特性，為此應在實驗室中準備一定數(shù)量相同批號的鍵合固定相（或色 譜柱），以保證分

41、析結果有良好的重現(xiàn)性。（3）鍵合相色譜分離的選擇性 在反相色譜分析中，使用同一種ODS固定相，并用兩種極性參數(shù)值相近，但由不同溶劑 組成的流動相時，會由于“溶劑誘導選擇性的變化”而獲得不同的結果。（4）鍵合相的再生 使用鍵合相色譜柱時，由于大量極性或非極性樣品的連續(xù)注入，會引起固定相對樣品的吸 附、締合等不良效應，而使柱分離性能變差，引起峰形變寬或拖尾等現(xiàn)像此時應及時對色 譜柱進行再生處理。對正相鍵合相柱可用11甲醇氯仿流動相來進行再生；對反相鍵合 相柱可用甲醇流動相再生，若效果不好，可使用丙酮、二甲基酰胺或約0.01mol/L無機酸水 溶液進行再生。正相色譜固定相最常用的正相色譜固定相硅膠最

42、常用的極性鍵合固定相氰基（CN）、氨基（NH2）等反相色譜固定相大多數(shù)是各種烴基硅烷的鍵合硅膠：如C2、C4、C6、C8、C16、C18和C22等 最常用的是C18，又稱ODS，即十八烷基硅烷鍵合硅膠測柱效-良好的色譜實驗習慣 評價色譜柱好壞的標準 1）理論塔板數(shù)N 2）拖尾因子Tf 3）色譜柱背壓 4）pH值的適用范圍 5）使用壽命理論塔板數(shù) N粒徑 (m)柱長 (cm)塔 板 數(shù) N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00

43、031012,000-14,00031517,000-20,000拖尾因子TfAs = 1.0-1.05 很 好As = 1.2 一 般As = 2 差As = 4 很差不對稱因子和拖尾因子的關系As (at 10%)Tf (at 5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不對稱因子 (As) = BAA拖尾因子 (Tf) = A + B2A10% 峰高5% 峰高色 譜 柱 背 壓粒徑均一會使色譜柱的背壓相對較低。色譜柱兩端的壓力降不應超過公式計算所得的30。硅膠粒徑對色譜柱的壓力具有很大的影響；硅膠粒子越小，色譜柱的背壓越大。色譜柱的背壓還與流動相的粘度有

44、關。P = 3000Lt0dp2P 是色譜柱背壓 (psi)，L 是色譜柱的長度 (cm), 流動相的粘度 (cP)， t0 是色譜柱死時間, dp 是粒子的直徑 (m)常用色譜柱的典型流速色譜柱的保護柱柱心柱套在使用新柱之前，最好用強溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 min，長時間未用的分析柱也要同樣 處理定期使用強溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時，要先用含低濃度有機溶劑的水溶液沖洗，再用有機溶劑沖洗4、凈化樣品5、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干枯6、使用預柱7、避免流動相組成及極性的劇烈變化8、避免壓力脈沖的劇烈變化分 析 柱 的 維 護色譜柱常見毛病柱壓過高多少

45、才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復性差不出峰，回收率低柱壓過高 為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細菌生長柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細小顆粒造成的堵塞色譜柱內的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯重復性差、回收率低實驗的重復性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強或流動相過弱非特異性吸附流動相選擇的一般要求化學穩(wěn)定性好，不與固定相和樣品組分發(fā)生化

46、學反應與所用檢測器相匹配，不影響檢測器的正常工作對分析樣品要有足夠的溶解能力，以利于提高檢測器的靈敏度 流動相的黏度要小，以保證合適的柱壓降 無毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境正相色譜流動相 常用流動相為烷烴：戊烷、己烷等 通過填加二氯甲烷、短鏈醇、四氫 呋喃等極性較大的溶劑來調節(jié)流動 相的極性 正相色譜最常用的流動相洗脫強度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇反相色譜流動相通常以水作為基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等反相色譜溶劑洗脫強度的強弱順序為： 水甲醇乙腈乙醇四氫呋喃丙醇二氯甲烷（其中二氯甲烷無法與水混溶，常用來清洗被強保

47、留樣品污染的色譜柱）在分離極性和離子型化合物時常采用緩沖溶液作為流動相水 的 等 級純化水蒸餾水去離子水波長 (nm)純化水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物吸光率溶 劑 等 級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2um的過濾,且除去有紫外吸收的雜質微量分析、梯度洗脫甲醇 乙睛 正己烷-為HPLC 級溶劑；為分析純級溶劑幾種常用溶劑的吸光度比較圖溶劑截止波長流動相的脫氣易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作氣泡會影響色譜柱的分離效率氣泡會影響檢測器

48、的靈敏度、基線的穩(wěn)定性溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相發(fā)生反應流動相必須脫氣常用的脫氣方法氦氣脫氣法 加熱回流法 抽真空脫氣法 超聲脫氣法 在線真空脫氣法流動相的過濾流動相用前均應過濾，尤其是配置的流動相所用濾膜為0.45m的孔徑或者更小孔徑的用濾膜過濾時，特別注意分清有機相濾膜和水相濾膜過濾的目的是除去微小顆粒，防止堵塞色譜柱和液路流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中貯存溶劑一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，同時防止空氣中的氧和二氧化碳溶于流動相中緩沖溶液極易長霉，應盡量現(xiàn)用現(xiàn)配貯存容器應經(jīng)常清洗，尤其是盛水、緩沖液和混合溶液的

49、瓶子流動相的貯存有機溶劑流動相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動相:當日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過3天防止長菌有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相:低溫密封保存防止有機相的揮發(fā)溶劑使用注意事項避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機溶劑中的有機酸溶液。含有強絡合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。LC-5500的使用、維護及應用液相色譜培訓（四）LC-5500高效液相色譜的使用與維護高液相色譜儀 開機前的準備工作 流動相和樣品的前處理

50、 過濾 脫氣 流動相的前處理：過濾設備和材料：溶劑過濾器、真空泵、 0.45m或更細的水 性濾膜和有機濾膜過濾的方法：用加了濾膜的溶劑過 濾器和真空泵抽濾過濾的目的：除去溶劑中的微小顆粒， 避免堵塞色譜柱和液路， 尤其是使用無機鹽配制 的緩沖液儲液瓶一個存放流動相的容器儲液瓶的材料應耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼、氟塑料，一般常用有機溶劑的原裝瓶作為儲液瓶用棕色玻璃瓶作為儲液瓶，可避免藻類的生長為保持流動相的純凈，應經(jīng)常清洗或更換儲液瓶流動相的前處理：脫氣脫氣的目的：使色譜泵的輸液準確 輸液均勻準確，且脈動減小。 保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比

51、增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化常用的脫氣方法氦氣脫氣法加熱回流法抽真空脫氣法超聲脫氣法在線真空脫氣法脫氣機超聲波清洗器樣品的前處理使用流動相溶解樣品 - 減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時由為重要 - 保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀 樣品需要過濾如果樣品中有氣泡，也要超聲脫氣LC-5500液相色譜儀組成簡圖P101泵鍵盤單向閥結構拋光面透明塑料墊片寶石球單向閥原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進口單向閥泵頭泵工作原理泵使用注意事項泵不能在沒有溶劑時空轉，否則活塞與泵缸的密封之間磨損會造成泄漏 泵不能用具有腐蝕性的物質，pH使用

52、范圍為28.5含鹽流動相使用后不能長期存放在泵中，隨著液體的蒸發(fā)，留下的少量鹽的晶體會磨損高壓密封圈和泵塞，所以在應用含鹽流動相后，一定要用純水徹底清洗泵 絕對不允許在大于最大允許壓力限定值（40MPa）下操作 LC-5500主機進樣閥檢測器電源柱箱電源調零旋鈕柱溫箱液晶顯示屏進樣方法 1.在INJECT（進樣）狀態(tài)下清洗閥口 2.在LOAD（裝填）狀態(tài)下插入微量注射器 3.注入樣品 4.切到INJECT（進樣）狀態(tài)進樣注意事項用注射器吸取樣品后，一定要排除氣泡后方可進樣將注射器針頭插入進樣口，直到針頭頂住進樣閥體平面為止，且不可用力過大，以免損傷閥體密封面緩慢推進注射針，使定量管完全充滿樣液

53、旋轉手柄時一定要快，否則對泵和柱子都會產(chǎn)生不良影響進樣量和檢測器響應的關系示意圖進樣體積 檢測器響應值定量環(huán)體積的一半2倍定量環(huán)體積全量注入部分注入進樣閥的沖洗進完樣后一定要及時沖洗進樣閥，特別是用含鹽緩沖液作流動相，由于這些溶液會形成結晶從而磨損墊圈將進樣閥轉至INJECT（進樣）位置，利用液相泵輸送純水沖洗定量環(huán)及溝槽，利用注射器沖洗進樣閥的閥口經(jīng)常用濕潤的軟布清潔進樣閥，特別是進樣口周圍進樣閥使用注意事項閥應該保持在LOAD或INJECT中的一個位置。如果閥處在兩者中間的位置，系統(tǒng)內的高壓可能會破壞其密封表面 只允許用平端的沖洗注射器和樣品注射器，絕對禁止用尖端（GC）注射器，以防劃傷閥

54、的密封面。柱溫箱結構圖柱箱門保護柱色譜柱接檢測器柱溫箱的使用注意事項打開柱溫箱電源開關，通過工作站軟件設定柱箱溫度使用柱恒溫箱時，應先輸入流動相然后再升溫；關機時則相反，即先關閉升溫電源，待色譜柱溫度降至室溫后方可停泵 在常溫下操作時，則不必打開柱溫箱電源 色譜柱日常使用注意事項過濾所有的溶劑和樣品使用保護柱不要把柱接頭上得太緊，損壞接頭螺紋易滲液開機時，流速和柱壓要逐漸增加注意色譜柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不能讓緩沖鹽溶液留存在色譜柱中，關機前要先用含低濃度有機溶劑的水溶液沖洗，然后再用純有機溶劑來保存柱子色譜柱的更換 對于反相色譜柱的更換：拆卸色譜柱時，必須先關斷柱箱電源。待色譜柱

55、柱溫降到室溫后，繼續(xù)用溶劑如甲醇沖洗色譜柱約20min；先卸下色譜柱出口端接頭，待有甲醇流出后再擰上螺帽；然后擰下色譜柱進口端接頭，繼續(xù)使甲醇滴入色譜柱，當柱進口端有甲醇溢出，且沒有氣泡時，表明色譜柱已被甲醇充滿，此時可再擰上保護性螺帽。換新色譜柱的程序相反。 色譜柱更換、保存注意事項沖洗或活化色譜柱時，流出液應放入廢液瓶中，千萬不可接到檢測器上，以免污染流通池按柱子進出口方向接入系統(tǒng)，不可更改色譜柱內應充滿溶劑，絕不可干燥放置。正相柱用正己烷或乙腈，反相柱用甲醇。用原配的柱端堵頭封緊柱兩端色譜柱存放時防止震動，以免損壞柱床檢測器的使用注意檢測器的波長通過工作站的軟件設定氘燈通電后在一分鐘內起

56、輝，然后進入工作狀態(tài)，一般氘燈穩(wěn)定需要0.51h，穩(wěn)定后就可以進樣分析 ，所以要等儀器達到穩(wěn)定狀態(tài)，也即基線走穩(wěn)后方可進行樣品分析注意液晶顯示屏所顯示的數(shù)字要為正，通過調零旋鈕調節(jié)基線與零點的位置，使基線在零點的上方。工作站界面整套液相色譜儀的維護1、在使用過含鹽緩沖液后，用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min，流量1mL/min。本步驟主要是沖洗干凈系統(tǒng)內含鹽緩沖液。2、用純的強溶劑（甲醇或乙腈）沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min以上，流量為1mL/min 。本步驟主要是保護色譜柱。3、如果未使用緩沖液，上面步驟1可免去，直接用純的強溶劑沖洗整個系統(tǒng)，時間為30min以

57、上，流量為1mL/min每次用過儀器后必須做!注意事項 流動相的選擇：對樣品易溶，且溶解度盡可能大化學性質穩(wěn)定，不損壞柱子不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收 黏度低，流動性好 無毒或低毒，易于操作易于制成高純度，即色譜純廢液易處理，不污染環(huán)境注意事項緩沖液的使用：使用前必須過濾 使用后一定要進行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、阻塞: 用甲醇-水溶液（甲醇：水=1：9）沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細菌和霉菌的影響，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配 不能直接用有機溶劑沖洗液相色譜常見問題及其對策液相色譜常見問題類型 A. 壓力異常（偏高、波動） B. 漏液 C. 保留時間漂移 D. 基

58、線問題（漂移、噪聲） E. 峰形異?，F(xiàn)象：無壓力，流動相不流動可能原因： 1、柱塞桿折斷 2、泵頭內有空氣或流動相不足 3、單向閥堵塞 4、漏液 5、壓力傳感器損壞(流動相流動正常，但無壓力)壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升可能原因： 1、流速設定過高 2、保護柱或柱子篩板堵塞 3、流動相使用不當或有緩沖鹽析出 4、色譜柱選擇不當 5、進樣閥損壞壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低可能原因： 1、流速設定過低 2、色譜柱選擇不當 3、柱溫過高 4、系統(tǒng)漏液壓力異常壓力異?，F(xiàn)象：壓力波動可能原因： 1、泵頭中有氣泡 2、單向閥損壞 3、柱塞密封圈損壞 4、脫氣不充分 5、系統(tǒng)漏液 6、使用了梯度洗脫漏

59、液接頭處漏液 可能原因： 1、接頭處松動 2、接頭磨損 3、接頭被污染 4、部件不匹配 漏液泵漏液 可能原因： 1、單向閥松動 2、泵密封圈損壞 3、接頭松動（不要擰的太緊）進樣閥漏液 可能原因： 1、轉子密封損壞 2、定量環(huán)堵塞 3、進樣口密封松動 4、進樣針尺寸不合適 5、廢液管產(chǎn)生虹吸 6、廢液管堵塞漏液檢測器漏液 可能原因： 1、流通池墊片損壞 2、流通池透鏡破碎 3、廢液管堵塞 4、流通池堵塞漏液保留時間漂移 可能原因： 1、柱溫變化 2、流動相組分變化 3、色譜柱沒有平衡好 4、流速變化 5、泵中有氣泡 6、流動相選擇不當 7、鍵合相流失保留時間漂移基線漂移 可能原因： 1、溫度波

60、動 2、流動相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑) 3、流通池被污染或有氣泡 4、流通池窗口破裂 5、流動相配比不當或流速變化 6、色譜柱沒有平衡 7、流動相污染、變質或由低品質溶劑配成 8、樣品中有強保留的物質以饅頭樣峰被洗出 9、檢測器沒有設定在最大吸收波長處基線問題基線噪聲（規(guī)則的） 可能原因： 1、流動相、泵、檢測器中有氣泡 2、有地方漏液 3、流動相混和不均勻 4、溫度影響（檢測器和柱溫差別太大） 5、其他電子設備的影響 基線問題基線噪聲（不規(guī)則的） 可能原因： 1、流動相污染、變質或由低質溶劑配成 2、有地方漏液 3、流動相各溶劑不相溶或混和不均勻 4、流通池污染 5、檢測池能量不足