《遺傳學(xué)》課件第12章 基因表達(dá)調(diào)控

1、第十二章 原核生物基因表達(dá)的調(diào)控本章學(xué)時(shí)數(shù)：3學(xué)時(shí)本章重點(diǎn)：乳糖操縱子模型何謂表達(dá)？ 表達(dá)涉及兩個(gè)環(huán)節(jié)：轉(zhuǎn)錄、翻譯. 基因工程中“高表達(dá)” high level expression，即高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。基因的表達(dá)是受到調(diào)節(jié)控制的：經(jīng)濟(jì)性 安全性 有序性哪些基因被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的效率如何。mRNA類型，mRNA數(shù)量。蛋白質(zhì)的類型，蛋白質(zhì)的數(shù)量。特定細(xì)胞的功能和屬性。細(xì)菌的乳糖代謝乳糖操縱子一、酶的誘導(dǎo)與阻遏 1900年，Dienert首次注意到酶的誘導(dǎo)作用，在酵母細(xì)胞的培養(yǎng)中，存在乳糖時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生與乳糖利用有關(guān)的酶；把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含葡萄糖的培養(yǎng)基，這種酶即消失. 結(jié)論：底物的存在能專一地誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生。

2、 當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖（lactose），而無葡萄糖時(shí)，細(xì)菌中專門代謝乳糖的酶類就迅速增加。 乳糖（lactose）既是底物（substrate）又起到了誘導(dǎo)物（inducer）的作用。1953年Monod發(fā)現(xiàn)酶的阻遏作用 大腸桿菌培養(yǎng)基中的色氨酸阻遏了色氨酸合成酶的合成.同等誘導(dǎo)或同等阻遏:大腸桿菌合成色氨酸所需的酶，5個(gè)編碼基因串聯(lián)在一起，而且排列順序也跟基因產(chǎn)物所催化的反應(yīng)順序相同。這種成串現(xiàn)象由Demerec等人于1955年首先觀察到。 從1946年起及隨后的10年，Jacques Monod、Joshua Lederberg、Francois Jacob以及Andre Lwoff 對乳糖

3、代謝的遺傳學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 E.coli能以乳糖（葡萄糖-4-D-半乳糖苷）這種雙糖作為唯一碳源。 乳糖進(jìn)入細(xì)胞后被分解為半乳糖和葡萄糖. 與乳糖代謝有關(guān)的三種酶： -半乳糖苷酶：水解乳糖為半乳糖和葡萄糖； -半乳糖苷透性酶：一種膜蛋白，協(xié)助乳糖穿膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 巰基半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶：將一個(gè)乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到-半乳糖苷上。 三種酶的編碼基因分別命名為lacZ 、 lacY和lacA，統(tǒng)稱為結(jié)構(gòu)基因，在染色體上相連在一起。lacZ：編碼-半乳糖苷酶（-galactosidase）四聚體，分解乳糖。乳糖半乳糖+葡萄糖-半乳糖苷酶lacY：編碼-半乳糖苷透性酶（permeas

4、ae）。膜蛋白，將乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。 lacA：編碼-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（transacetylase）。二聚體; 把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上。 培養(yǎng)中C源不是乳糖時(shí)，三種酶在細(xì)胞內(nèi)的含量很低，只有幾個(gè)分子或不到。 如果用乳糖代替葡萄糖，則在幾分鐘內(nèi)，每個(gè)cell轉(zhuǎn)錄出30-50個(gè)mRNA模板，產(chǎn)生3000多個(gè)-半乳糖苷酶分子，另兩種酶的量也迅速增加，一旦乳糖耗盡，三種酶的合成同時(shí)停止。 這里，乳糖被當(dāng)作誘導(dǎo)物，并被-半乳糖苷酶催化分解，一些不能被該酶分解的半乳糖苷也可作為誘導(dǎo)物，如IPTG （異丙基-D-硫代半乳糖苷） IPTG有誘導(dǎo)效應(yīng)而本身不被分解，稱為安慰誘導(dǎo)物(grat

5、uitous inducer) constitutive 不需誘導(dǎo)、持續(xù)地合成. 誘導(dǎo)型的合成（如-半乳糖苷酶也可能產(chǎn)生組成型突變體mutant） 乳糖操縱子模型有關(guān)的試驗(yàn)中，利用了： 組成型突變體 部分二倍體技術(shù)（性導(dǎo), F因子）組成型合成Joshua Lederberg為了研究乳糖代謝的三個(gè)酶的基因，分離了大量的突變體（lac -），并經(jīng)過遺傳作圖發(fā)現(xiàn)它們是緊密連鎖的：Z-Y-A乳糖操縱子模型同時(shí)發(fā)現(xiàn)它們是被同時(shí)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的。 雅科Jacob和莫諾Monod根據(jù)試驗(yàn)事實(shí)提出了操縱子模型operon model。認(rèn)為這三個(gè)酶的基因轉(zhuǎn)錄受一個(gè)開關(guān)單位的控制。操縱子模型（Operon Model）

6、1960年，Jacob和Monod提出了操縱子模型，說明乳糖誘導(dǎo)代謝是一個(gè)負(fù)控制（negative control）。獲1965年Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎操縱子模型對乳糖誘導(dǎo)效應(yīng)的解釋 LacI 編碼了一個(gè)阻遏物(repressor)，與結(jié)構(gòu)基因附近的一個(gè)“假想”位置（命名為operator site）結(jié)合, 從而抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 該阻遏物能變構(gòu)（allosteric）。即它還能與乳糖結(jié)合，改變構(gòu)像而喪失了與operator DNA結(jié)合的能力，結(jié)構(gòu)基因才能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 調(diào)節(jié)基因編碼的產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)分子，稱為阻遏物。當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)沒有乳糖時(shí)，阻遏物結(jié)合到操縱基因上，阻止了RNA聚合酶的通過，所

7、以結(jié)構(gòu)基因得不到轉(zhuǎn)錄。 培養(yǎng)基加入乳糖后，乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏物的構(gòu)象改變。阻遏物的構(gòu)象改變后，失去了與操縱基因結(jié)合的能力，阻遏物從操縱基因上解離下來。于是轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。 Jacob和Monod未提出啟動基因區(qū)（RNA聚合物識別并結(jié)合的區(qū)域）P（Promotor，又叫啟動子） ,后來由伊彭提出。 啟動子：由兩個(gè)盒組成，以轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為+1，-35的TTGACA盒是RNA聚合酶的識別位點(diǎn)，-10的TATAAT盒（Pribnow盒），是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。 這樣，操縱子的概念：最初的操縱子=操縱基因+結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)一步成為 操縱子包括：啟動基因+操縱基因+結(jié)構(gòu)基因。 操縱子（ope

8、ron）: 功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因在染色體上成簇（cluster）排列, 由一個(gè)共同的控制區(qū)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,是原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本單位.由結(jié)構(gòu)基因（structural genes）和上游相鄰的控制區(qū)（regulatory region）組成。 一個(gè)操縱子轉(zhuǎn)錄后形成一個(gè)多順反子mRNA(polycistronic)。對模型的遺傳學(xué)驗(yàn)證組成型突變（constitutive mutants）沒有乳糖，代謝酶照樣合成（不需要誘導(dǎo)）。遺傳作圖發(fā)現(xiàn)：這種突變（lacOc）的基因緊密連鎖在結(jié)構(gòu)基因的上游（operator region）。另一個(gè)組成型突變（lacI-）作圖的結(jié)果是在離結(jié)構(gòu)基因不遠(yuǎn)處。野生型組

9、成型突變lacOclacI-根據(jù)操縱子模型的原理，可以預(yù)測：模型預(yù)測1. lacI基因產(chǎn)物是個(gè)可擴(kuò)散的（diffusible）蛋白。2. O區(qū)（operator region）在調(diào)節(jié)過程中起作用，但不編碼產(chǎn)物。3. O區(qū)必須緊靠結(jié)構(gòu)基因。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 Pardee、Jacob、Monod設(shè)計(jì)了歷史性的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)他們的模型的預(yù)測是否正確。1. 實(shí)驗(yàn)原理2. 實(shí)驗(yàn)過程通過F因子，給lacI-或lacOc的突變菌輸入野生型lacI或lacO基因，觀察其對-半乳糖苷酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)1：組成型突變lacI- lacZ+F菌株F lacI+ lacZ-乳糖誘導(dǎo)型菌說明F菌株的lacI+能彌補(bǔ)原菌株的lacI

10、-缺陷。即：lacI 對lacZ是反式作用（trans-acting）。組成型突變lacI+ lacOc lacZ+F菌株F lacI+lacO+ lacZ-組成型表達(dá)實(shí)驗(yàn)2：說明F菌株的lacO+不能彌補(bǔ)原菌株的lacOc缺陷。即：lacO對lacZ是順式作用（cis-acting）。實(shí)驗(yàn)3lacI超突變（lacIs）編碼的阻遏物不能與乳糖結(jié)合，所以總是結(jié)合在O區(qū)的DNA上，使lacZ不能表達(dá)。野生型lacI+ lacZ+F菌株超突變F lacIs lacZ+組成型不表達(dá)說明超突變lacIs 編碼的阻遏物能作用于野生型菌操縱子的O區(qū)。利用超突變：操縱子模型的意義Jacob和Monod1961

11、年發(fā)表的操縱子理論是遺 傳學(xué)的的一個(gè)里程碑（landmark）。 用遺傳分析結(jié)果推論出分子生物學(xué)模型并驗(yàn)證。 暗示了蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的概念。描述了“阻遏物”的調(diào)節(jié)因子概念（盡管當(dāng)時(shí)并不知道它是蛋白質(zhì)還是RNA）。 當(dāng)時(shí)人們剛知道m(xù)RNA，對轉(zhuǎn)錄的細(xì)節(jié)一無所知！附：阻遏物的分離和鑒定阻遏物的含量極少，每細(xì)胞不超過10份。直到1966年，Walter Gilbert和Benno Muller-Hill從lacI的超量突變菌株中，利用透析（dialysis）的方法，通過IPTG與阻遏物的結(jié)合作用，分離到了這個(gè)蛋白質(zhì)。Gilbert及其同事又用放射自顯影證明它能與lacO DNA結(jié)合。 分離鑒定放射

12、性標(biāo)記的阻遏物能與野生型O區(qū)結(jié)合放射性標(biāo)記的阻遏物不能與突變型O區(qū)結(jié)合Lac 阻遏物的空間結(jié)構(gòu)兩個(gè)binding domian:四聚體聚合區(qū)CN一個(gè)四聚體聚合區(qū)阻遏物與DNA的結(jié)合i）電鏡觀察Lac repressorii）X-ray分析兩個(gè)單體結(jié)合在一個(gè)完整的lacO區(qū)；四聚體可以結(jié)合兩個(gè)lacO。iii）DNA測序分析阻遏物所結(jié)合的DNA有26bp（-5 +21）。位于RNA多聚酶結(jié)合部位的下游內(nèi)部。GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTATGmRNAproteinRNA pol binding siterepressor binding site對稱軸乳糖操縱子的正調(diào)控（p

13、ositive control）Jacob-Monod 模型沒能回答一個(gè)關(guān)鍵性的問題：為什么E.coli 在既含有葡萄糖（glucose）又含有乳糖的（lactose）的培養(yǎng)基（medium）中不啟動lac 操縱子的轉(zhuǎn)錄？Answers to this question emerged from molecular studies carried out long after publication of the operon theory.（1）正調(diào)控因子（positive regulator）在有些啟動子上，RNA pol結(jié)合后并不能啟動轉(zhuǎn)錄。必須一個(gè)激活因子（正調(diào)節(jié)因子）的幫助才能打開D

14、NA雙鏈。CAP是lac operon的正調(diào)節(jié)因子。（2）CAP的作用原理 cAMP+CAP cAMP-CAP復(fù)合體 cAMP-CAP與lac操縱子啟動基因上的一個(gè)位置結(jié)合后 ，RNA聚合酶才能與啟動子結(jié)合。 cAMP是由ATP經(jīng)過腺苷酸環(huán)化酶（Adenyl cyclase）的作用形成。ATPcAMPAdenyl cyclase 葡萄糖抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，從而間接地抑制了Lac操縱子的轉(zhuǎn)錄。 CAP-cAMP系統(tǒng)在半乳糖和阿拉伯糖操縱子中也起作用。 葡萄糖濃度 cAMP 葡萄糖濃度 cAMP（3）CAP與DNA的結(jié)合lac操縱子中，CAP結(jié)合位點(diǎn)位于RNA pol結(jié)合位點(diǎn)的上游（-22bp）。結(jié)合部位位置不同的操縱子中，CAP的結(jié)合位置不同。operatorCAP promotor結(jié)構(gòu)基因半乳糖乳糖阿拉伯糖結(jié)構(gòu)基因operatorpromotorCAP operatorCAP promotor結(jié)構(gòu)基因以二聚體形式與DNA結(jié)合。使DNA彎曲90度。結(jié)合形式TGTGAGTTAGCTCACACACTCAATCGAGTG結(jié)合處DNA的保守序列回文順序每一部分結(jié)合一