代謝工程的應(yīng)用

1、植物代謝工程研究進(jìn)展概述植物次生代謝及其產(chǎn)物在植物與環(huán)境互作和整個(gè)生命活動(dòng)中行使著重要的功能：它們可構(gòu)成植物防御體系的一部分（單寧和棉酚等抗病蟲化合物1，參與植物的逆境脅迫反應(yīng)（如甜菜堿、甘露醇等）。棉花抗蚜蟲機(jī)制的研究結(jié)果表明，次生代謝物（棉酚、單寧和黃酮類等）及其相關(guān)酶基因的時(shí)空表達(dá)和積累所造成的生化異質(zhì)性是植物防御蟲害的主要機(jī)制之一。一些次生代謝物（如花青素等）使花瓣產(chǎn)生各種色澤、吸引昆蟲傳粉，有利于植物繁殖。生長素等次生代謝物可調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。此外，許多植物次生代謝產(chǎn)物還具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。25的臨床藥物都是直接或間接地來自于植物的次生代謝產(chǎn)物。植物次生代謝物還可用于生產(chǎn)染料、殺蟲劑

2、、食品的調(diào)味劑及香料等。因此，對植物次生代謝進(jìn)行遺傳改良，以培育能夠大量合成和積累目標(biāo)次生代謝物的品種，受到科研工作者愈來愈多的關(guān)注。應(yīng)用常規(guī)育種方法改良植物次生代謝已有成功的經(jīng)驗(yàn)，富含芥子油苷的花椰菜品種的育成就是一例。芥子油苷被認(rèn)為有預(yù)防癌癥的功效，它是作為抗癌變的標(biāo)識酶即苯酮還原酶的誘導(dǎo)物來起作用的。新育成雜交種在誘導(dǎo)此酶的能力上提高了100倍。然而植物次生代謝物種類繁多，生物合成途徑也千差萬別，應(yīng)用常規(guī)技術(shù)改良植物次生代謝的遺傳特性進(jìn)展緩慢。隨著對植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)的研究和認(rèn)識的深入，以及分子克隆和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用基因工程對植物次生代謝途徑的遺傳特性進(jìn)行改造已成為具有廣闊應(yīng)用

3、前景的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。迄今，已建立的植物次生代謝途徑基因修飾的策略主要有，導(dǎo)人單個(gè)、多個(gè)靶基因（例如編碼目標(biāo)途徑限速酶的基因）或一個(gè)完整的代謝途徑，使宿主植物合成新的目標(biāo)產(chǎn)物；通過反義RNA和RNA干涉等技術(shù)減少靶基因的表達(dá)，從而抑制競爭性代謝途徑，改變代謝流向和增加目標(biāo)產(chǎn)物的含量；對控制多個(gè)生物合成基因的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行修飾，更有效地調(diào)控植物次生代謝以提高特定化合物的積累。目前，在基因水平上研究得最清楚的植物次生代謝途徑是合成黃酮類及花青素的次生代謝途徑。已經(jīng)鑒定出許多具有重要醫(yī)藥價(jià)值的次生代謝物，如吲哚和異喹啉類生物堿等。植物次生代謝基因工程分類次生代謝產(chǎn)物（secondarymetabolit

4、es）的低產(chǎn)現(xiàn)象是制約細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要瓶頸之一71。針對這一問題，國內(nèi)外研究者從細(xì)胞系選育，培養(yǎng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)技術(shù)改進(jìn)等方面進(jìn)行了廣泛的研究。然而到目前為止植物培養(yǎng)細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)問題仍未得到很好解決。近年來，隨著分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，從分子水平上對植物細(xì)胞的次生代謝進(jìn)行調(diào)控以提高次生產(chǎn)物的含量已成為國內(nèi)外植物細(xì)胞代謝調(diào)控研究中一個(gè)非?；钴S的領(lǐng)域，并被視為是解決植物培養(yǎng)細(xì)胞中次生產(chǎn)物低產(chǎn)問題的一條新途徑t。人們嘗試?yán)没蛘{(diào)控手段來調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的次生代謝，如采用關(guān)鍵酶基因調(diào)控技術(shù)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控技術(shù)等從分子水平上解決藥用植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)問

5、題。植物次生代謝途徑的基因工程主要有次生代謝關(guān)鍵酶基因工程及其轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)基因的基因工程兩個(gè)方面。21次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因工程211基因的添加通過基因工程提高控制某一特定次生代謝物合成的限速酶活性或在植物中引入新的次生代謝物合成途徑，可提高轉(zhuǎn)基因植物目標(biāo)次生代謝物含量或合成外源次生代謝物。前一種策略可通過強(qiáng)啟動(dòng)子與關(guān)鍵酶基因的嵌合轉(zhuǎn)化，后一種策略往往采用次生代謝物合成途徑中下游一個(gè)或若干個(gè)有關(guān)鍵酶基因的協(xié)同轉(zhuǎn)化。例如，HMGR基因在煙草中的組成型表達(dá)，導(dǎo)致了甾醇環(huán)阿屯醇合成量的提高_(dá)1。1。將長春花的TDC連接組成型啟動(dòng)子再轉(zhuǎn)人到長春花中，轉(zhuǎn)基因長春花中色胺的含量有顯著增加；將長春花中

6、TDC和STR的嵌合基因連接組成型啟動(dòng)子再轉(zhuǎn)人長春花，轉(zhuǎn)基因長春花培養(yǎng)細(xì)胞中萜類吲哚生物堿含量有所提高。將次生代謝物合成途徑的下游關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物，在植物細(xì)胞內(nèi)存在反應(yīng)底物時(shí)，外源基因的表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因植物啟動(dòng)新的次生代謝物合成支路。例如，將花生芪合酶(STS)基因轉(zhuǎn)入煙草，使轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)了STS酶活性，合成了白藜蘆醇并使轉(zhuǎn)基因煙草的抗病水平有了顯著的提高。212基因的剔除對于部分不利于營養(yǎng)品質(zhì)或加工品質(zhì)提高的植物次生代謝物，可通過反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化抑制其合成途徑中有關(guān)基因的表達(dá)，減少植物合成特定次生代謝物，從而提高植物產(chǎn)品的品質(zhì)。例如，通過反義基因技術(shù)，可降低飼料和樹木中木質(zhì)素含量，從

7、而提高飼料的飼用價(jià)值和木材的造紙質(zhì)量和效益。22次生代謝途徑中調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)錄因子的基因工程特定次生代謝物合成主要是通過其合成途徑中的多個(gè)合成酶活性表達(dá)所決定的，這些合成酶的活性表達(dá)受到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子及其它調(diào)控基因的調(diào)節(jié)，其中，轉(zhuǎn)錄因子對合成酶基因的轉(zhuǎn)錄激活是植物次生代謝最為重要的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)之一。轉(zhuǎn)錄因子通過激活植物次生代謝物合成途徑中多個(gè)合成酶基因的表達(dá)，可有效地啟動(dòng)或關(guān)閉次生代謝合成途徑，從而調(diào)節(jié)特定次生代謝物的合成。轉(zhuǎn)錄因子的基因工程是植物次生代謝遺傳改良的有效途徑，隨著植物次生代謝調(diào)控機(jī)制的闡明，特別是隨著調(diào)節(jié)特定次生代謝物合成的轉(zhuǎn)錄因子的分離和鑒定，轉(zhuǎn)錄因子基因工程將為人類開發(fā)利用植物次

8、生代謝物提供有效的手段。對于涉及多個(gè)基因表達(dá)的植物次生代謝，同時(shí)增強(qiáng)多個(gè)基因的協(xié)同表達(dá)是提高次生代謝物產(chǎn)量所必需的。次生代謝途徑中多個(gè)酶基因的協(xié)同表達(dá)與這些基因調(diào)控序列中相同或相似的順式作用元件受到相同的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)基因的作用有關(guān)。因此，增強(qiáng)這些重要酶基因的轉(zhuǎn)錄因子基因或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)多個(gè)基因協(xié)同表達(dá)的可行途徑。目前已分離了多種有關(guān)次生代謝基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)錄因子基因，為開展植物次生代謝基因工程開辟了新途徑。例如，已從玉米中分離了Myb區(qū)域和bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因R、B、C1和P,從擬南芥中分離了AN11、TTG1、PAP1等類黃酮合成的調(diào)節(jié)蛋白基因，從長春花中分離了ORCA3

9、(茉莉酸誘導(dǎo)型的AP2區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子)17-181。將玉米的R和C1基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，花色素苷大量合成；ORCA3基因在長春花中的組成型表達(dá)，使生物堿合成途徑中的酶的表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致了萜類吲哚生物堿合成量的提高。植物次生代謝的基因工程只有采取針對特定次生代謝物合成的限速酶多基因家族的特定成員并結(jié)合誘導(dǎo)型或發(fā)育、組織器官特異性啟動(dòng)子，才有可能獲得預(yù)期的目標(biāo)。通過基因添加，將多個(gè)基因共轉(zhuǎn)化，在目標(biāo)植物中開啟新的次生代謝物合成支路是對植物進(jìn)行次生代謝遺傳修飾的有效途徑之一；另一方面，植物次生代謝調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)錄因子的基因工程在強(qiáng)化植物特定次生代謝中也極具應(yīng)用潛力。3反義核酸與RNA

10、干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)反義核酸是指能夠與靶DNA或RNA片斷互補(bǔ)、結(jié)合的一段DNA或RNA序列，反義核酸技術(shù)即利用反義核酸關(guān)閉目標(biāo)基因表達(dá)的技術(shù)。目前，應(yīng)用該技術(shù)對植物次生代謝調(diào)控常常與關(guān)鍵酶基因技術(shù)相結(jié)合。在藥用植物次生代謝調(diào)控過程中可以利用反義核酸技術(shù)關(guān)閉某個(gè)基因的表達(dá)或切斷某個(gè)代謝分支，從而使合成代謝向預(yù)期目標(biāo)轉(zhuǎn)移。紫草中暗誘導(dǎo)基因LeDI一2是紫草寧合成過程中的關(guān)鍵編碼基因，利用反義核酸技術(shù)將其表達(dá)抑制后會降低紫草寧的產(chǎn)量。盡管是對目的產(chǎn)物的負(fù)調(diào)節(jié)，但說明利用反義核酸技術(shù)對代謝途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)是可行的。當(dāng)然，由于植物細(xì)胞內(nèi)反饋抑制等多種調(diào)節(jié)機(jī)制的存在，以及目前

11、藥用植物功能基因組和次生代謝途徑研究還不夠深入，為利用該技術(shù)提高細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物量，尤其是對細(xì)胞具有一定毒性的防御性次生代謝產(chǎn)物的量帶來了一定的難度。RNAi是指特定的雙鏈RNA分子使基因在轉(zhuǎn)錄或翻譯階段沉默的現(xiàn)象，利用RNA分子可以對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。張蔭麒122制用反義DNA或RNA片段導(dǎo)入亞麻植物毛狀根中抑制肉桂醇脫氫酶活性，使分支代謝中木質(zhì)素的合成受到抑制，而使主要抗癌活性成分5一甲氧基鬼臼素的含量提高。Allen等利用該技術(shù)使罌粟中的可待因酮還原酶(codeinonereductase,COR)基因家族沉默，阻斷了阿片類物質(zhì)的合成，同時(shí)導(dǎo)致可待因前體物質(zhì)網(wǎng)狀番荔枝堿(s)reti

12、culine大量累積，而番荔枝堿是治療瘧疾的有效成分。利用RNAi技術(shù)對藥用植物細(xì)胞次生代謝途徑中的目的基因進(jìn)行調(diào)控，為一種新的分子調(diào)控策略。植物次生代謝物生物合成途徑的基因修飾1生物堿合成途徑的基因修飾3.1.1吲哚生物堿生物堿是含氮有機(jī)化合物中最大的一類次生代謝物，主要包括異喹啉類、吲哚類和多炔類等，許多生物堿是藥用植物的有效成分。Park等1已經(jīng)證明罌粟細(xì)胞中的黃連素橋接酶具有反饋抑制作用，會減少苯菲啶的產(chǎn)量，但會增加多種氨基酸的產(chǎn)量。近年來科學(xué)家們已經(jīng)開始努力研究吲哚類生物堿的生物合成途徑，這些途徑能合成具有重要藥用價(jià)值的化合物，如具有抗癌作用的長春花堿和長春花新堿、喜樹堿等。Whit

13、mer等z51將裂環(huán)馬錢子苷添加到帶有STRcDNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的培養(yǎng)物中，在低色氨酸脫羧酶(TDC)情況下，色胺合成速率高，只要有少量色胺存在即可提高裂環(huán)馬錢子苷合成速率，同時(shí)誘導(dǎo)因子的添加也能提高總堿含量。將編碼長春花TDC和STR的cDNA用CaMV35s啟動(dòng)子轉(zhuǎn)人煙草中，TDC的活力基本不變，STR活力提高26倍，飼喂環(huán)馬錢子苷后轉(zhuǎn)化物中積累了異胡豆苷。3.1.2異喹啉生物堿黃連素、嗎啡和可待因等異喹琳生物堿是重要的醫(yī)用藥物。對合成這類生物堿的次生代謝途徑進(jìn)行基因工程改良，經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高。有關(guān)黃連素生物合成途徑的研究發(fā)現(xiàn)，13種不同的酶參與從酪氨酸到黃連素合成過程。Frick等26】提

14、出了另一條遺傳改良的策略，即通過對具有不同底物特異性的酶進(jìn)行基因修飾，從而使植物能夠合成新的生物堿。他們對塊根唐松草0一轉(zhuǎn)甲基酶亞基進(jìn)行重組，使其形成異型二聚體酶，它的底物特異性與同型二聚體酶的底物特異性不同這一異型二聚體酶的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞合成新的生物堿。313莨菪烷生物堿和吡咯烷生物堿東莨菪堿和顛茄堿等莨菪烷生物堿是一類重要的藥物，這些次生物質(zhì)主要在茄科天仙子屬、顛茄屬、Dudoisia屬和莨菪屬等植物中合成。該生物堿代謝途徑基因工程的主要目標(biāo)之一是通過遺傳修飾使植物本身能夠?qū)⑻煜勺影?Hyoscyamine)轉(zhuǎn)化生成醫(yī)藥價(jià)值更高的東莨菪堿(scopolamine)(可用做鎮(zhèn)靜劑)。Jouh

15、ikainen等1將編碼H6Hd的基因?qū)朐撝参?，并使該基因在毛狀根?xì)胞中超表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系中東莨菪堿含量比非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系中東莨菪堿含量高100倍，而天仙子胺含量在轉(zhuǎn)基因植物根部和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旮縿t基本相近。Zhang等(2004)在國際上首次利用基因共轉(zhuǎn)化技術(shù)將PMT和H6H基因?qū)胼馆邪l(fā)根中，使轉(zhuǎn)基因莨菪發(fā)根中東莨菪堿含量提高了9倍。32萜類化合物生物合成途徑的基因修飾萜類化合物是異戊二烯單元(5碳)組成的化合物，通過異戊二烯途徑(3Z稱甲羥酸途徑)合成，由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)異戊二烯單元分別組成產(chǎn)生的單萜、倍半萜和二萜稱為低等萜類，單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油的主要成分，也是香料

16、的主要成分，植保素很多是一些倍半萜和二萜化合物。萜類化合物雖然形態(tài)各異，但所有的萜類化合物都是從異戊二烯基二磷酸fIPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)聚合而成。將LIS基因?qū)送炼怪校谒禺愋詥?dòng)子的作用下能引起土豆中芳樟醇的積累。許多水果、蔬菜和鮮花的香味來源于揮發(fā)性萜類化合物，通過萜類代謝基因工程改良植物的香味也有成功的實(shí)例。此外，萜類代謝基因工程在提高植物抗性和增加一些藥物生物合成方面也取得了成功。Wang等采用共抑制和反義策略敲除煙草毛狀腺體中細(xì)胞色素P450單加氧酶基因的表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致了毛狀腺體中萜類化合物組成的改變，雙萜embratrieneol增加了19倍，使轉(zhuǎn)基因煙草

17、對蚜蟲的抗性也明顯提高。Chen等1將來自棉花的法呢基二磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,FDS)基因?qū)它S花蒿中，通向倍半萜生物合成途徑的代謝流明顯增加，導(dǎo)致抗瘧類藥物一青蒿素比野生株系高23倍。33黃酮類生物合成途徑的基因修飾黃酮類化合物是一種小分子酚類物質(zhì)，廣泛存在于植物界，具有多種生物功能，如調(diào)節(jié)植物生長，保護(hù)植物免受紫外線的損傷和抗病蟲等。花青素和黃酮類物質(zhì)還具有較高的抗氧化活性，富含這兩種物質(zhì)的植物食品有利于人類健康和疾病預(yù)防。對這兩條生物合成途徑的研究比較清楚，其生物合成途徑的改變能很容易通過花色的改變來鑒定oMuir等l321發(fā)現(xiàn)查爾酮異構(gòu)酶(C

18、HI)是增加黃酮醇產(chǎn)物的關(guān)鍵酶。將查爾酮合成酶和黃酮醇合成酶基因?qū)朔押?，轉(zhuǎn)基因果肉中黃酮醇類物質(zhì)積累顯著增加，表明應(yīng)用基因工程技術(shù)增加番茄果實(shí)中有益于人體健康的化合物生物合成量是可行的。豆類植物的異黃酮是一類植物抗毒素，在植株受微生物侵染后，這些抵抗微生物的活性化合物可被誘導(dǎo)合成。正常情況下，擬南芥、煙草和玉米等植物缺少合成這類化合物的能力。Jung等將一種細(xì)胞色素P450單加氧酶一異黃酮合成酶的基因?qū)脒@些植物，使該基因超表達(dá)，這些轉(zhuǎn)基因植物均能合成異黃酮類物質(zhì)。因此，苯丙烷類代謝途徑的基因工程可進(jìn)一步應(yīng)用于提高異源植物中異黃酮的生物合成。34醌和苯甲酸衍生物生物合成途徑的基因修飾醌是從

19、苯甲酸衍生而來的環(huán)化合物，作為植物中的電子傳遞物起作用。植物中從苯甲酸開始的分別合成水楊酸、紫草寧和維生素E的代謝途徑已經(jīng)有被改進(jìn)的例子。目前已經(jīng)證實(shí)在擬南芥中可以增加維生素的含量，例如Savidgec等已經(jīng)將擬南芥2,5一二羥苯乙酸異戊烯轉(zhuǎn)移酶過度表達(dá)使普通植物中的維生素E的含量增加2倍。編碼2一甲基一6一葉綠甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶和一生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的擬南芥VTE3和VTE4基因的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因大豆的一生育酚的含量比原來增加了8倍，而維生素E的含量增加了5倍。35新的代謝途徑代謝工程過去經(jīng)常修飾或擴(kuò)展寄主植物中已經(jīng)存在的途徑，但是目前已經(jīng)有把基因工程用在全新的代謝途徑中，以此來生產(chǎn)不同的產(chǎn)物的例

20、子。例如將高粱中的兩個(gè)多功能細(xì)胞色素酶P450和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)到擬南芥中，產(chǎn)生含氰蜀黍糖。藥用植物次生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆在藥用植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)中，一些關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平對某些目的產(chǎn)物的生物合成水平有著重要的調(diào)節(jié)作用。將次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因克隆，重組后導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，通過提高次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性和數(shù)量，增加代謝強(qiáng)度，提高目的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。利用關(guān)鍵酶基因調(diào)控技術(shù)調(diào)控局部代謝途徑中的某個(gè)限速步驟，對提高藥用植物細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的含量有一定效果，但也存在不足之處。首先，由于植物細(xì)胞次生代謝是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，僅僅依靠增加代謝途徑中一兩個(gè)關(guān)鍵酶基因

21、的表達(dá)水平往往對產(chǎn)物的代謝流量增加作用效果有限3一91。其次，目前對許多藥用植物次生產(chǎn)物的代謝途徑研究尚不深入，因而克隆這類代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的難度較大，制約了該技術(shù)在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用。近年來，藥用植物有效成分的生物合成基因調(diào)控研究進(jìn)展迅速，克隆了抗腫瘤藥物紫杉醇、長春花堿、抗菌藥紫草寧、抗瘧疾藥青蒿素以及鎮(zhèn)痛藥嗎啡等次生代謝物的生物合成相關(guān)酶的基因。應(yīng)用功能基因組學(xué)方法研究植物次生代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，后基因組時(shí)代的到來，人們更加注重功能基因的研究。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后出現(xiàn)的一門新學(xué)科，已成為后基因組學(xué)時(shí)代的一個(gè)非常重要的分支。代謝組學(xué)為研究

22、植物復(fù)雜代謝過程及其產(chǎn)物，分析植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、限速步驟、解析細(xì)胞活動(dòng)過程，以及尋找植物間的親緣關(guān)系等提供了可能。將植物代謝分析的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合將有利于建立基因和代謝產(chǎn)物之間的完整網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從而為進(jìn)一步全面闡明植物代謝規(guī)律及其關(guān)鍵步驟奠定基礎(chǔ)。圖1（略）所示為一種利用功能基因組學(xué)研究植物次生代謝途徑及調(diào)控機(jī)制的方法，此方法是以大通量篩選和分析參與次生代謝的基因?yàn)榛A(chǔ)的。從理論上說，該方法適用于任何植物或細(xì)胞培養(yǎng)物。最近對煙草細(xì)胞中尼古丁的生物合成代謝的研究驗(yàn)證了這個(gè)方法的可行性。用茉莉酸甲酯處理煙草細(xì)胞，比較分析處理后一段時(shí)間內(nèi)cDNA擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性轉(zhuǎn)錄譜和

23、目的代謝產(chǎn)物圖譜。結(jié)果在2萬個(gè)檢測到的差異片段中有591個(gè)為誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因，其中58的基因具有已知的功能，包括了幾乎所有已知的參與尼古丁生物合成的基因。對其余未知功能基因的研究將有助于闡明尼古丁生物合成代謝及調(diào)控機(jī)理14。Rischer等俐用該方法研究長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系萜類生物堿合成，獲得了417個(gè)受茉莉酸甲酯調(diào)控的基因標(biāo)簽，分離出幾乎所有的已報(bào)導(dǎo)的萜類生物堿合成途徑相關(guān)的基因。植物次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜，而且具有化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性。這是利用功能基因組學(xué)方法研究次生代謝時(shí)遇到的普遍問題雖然應(yīng)用功能基因組學(xué)方法研究植物次生代謝還有許多問題需要解決，但功能基因組學(xué)將會大大加速克隆參與次生代謝的酶

24、的基因，為應(yīng)用生物技術(shù)提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。植物成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性比人類所建的任何一個(gè)化學(xué)庫要多得多，植物作為一個(gè)巨大藥物資源庫越來越引起人們的關(guān)注。目前人類面臨多種頑疾的威脅，如癌癥、心血管病及多種傳染性疾病等。由于合成化學(xué)的局限性，在植物次生代謝產(chǎn)物中尋找新藥，也是制藥產(chǎn)業(yè)新的希望。參考文獻(xiàn)略基金項(xiàng)目：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后基金和博士啟動(dòng)基金資助代謝基因工程提高作物產(chǎn)量的分子靶標(biāo)作者：qiusuo收錄日期：2005-11-15發(fā)布日期：2005-11-15世界人口的增長，可耕地面積逐漸減少和農(nóng)業(yè)環(huán)境的惡化，使得世界糧食安全問題日趨嚴(yán)重。常規(guī)育種技術(shù)所培育的優(yōu)良作物品種，為解

25、決世界糧食問題做出了重大貢獻(xiàn)。然而，近20年來各種作物產(chǎn)量均呈現(xiàn)徘徊局面，新育成的品種在產(chǎn)量潛力上沒有大的突破，常規(guī)育種技術(shù)在繼續(xù)提高糧食產(chǎn)量方面的潛力有限。基因工程技術(shù)的誕生和發(fā)展為作物進(jìn)行遺傳改良開辟了新途徑。尤其是對一些質(zhì)量性狀的遺傳改良，應(yīng)用基因工程技術(shù)更有效?，F(xiàn)今通過基因工程培育的抗蟲、抗病、抗除草劑等作物（大豆，玉米和棉花等）品種已商品化。作物產(chǎn)量是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，與植株的許多性狀有關(guān)。以提高作物產(chǎn)量為目標(biāo)的基因工程，顯然要比單個(gè)質(zhì)量性狀的遺傳改良難度大和復(fù)雜。盡管如此，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和對作物高產(chǎn)性狀、高產(chǎn)機(jī)理及其相關(guān)基因的研究愈加深入，已相繼建立了一些應(yīng)用基因工程技術(shù)提高

26、糧食作物產(chǎn)量的技術(shù)策略。例如，雄性不育系的培育和雜優(yōu)利用，改良作物對病蟲及環(huán)境脅迫的抗（耐）性等。代謝基因工程的發(fā)展使得人們能夠通過對植物細(xì)胞代謝進(jìn)行遺傳修飾而改變細(xì)胞本身代謝途徑，以增加目標(biāo)物質(zhì)的積累或合成新的化合物。光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等是形成作物產(chǎn)量的基礎(chǔ)代謝。近年來，對這些代謝途徑中的關(guān)鍵步驟和靶分子進(jìn)行基因修飾以提高作物產(chǎn)量的研究已取得長足的進(jìn)步，拓展了有關(guān)植物代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識。結(jié)合我們的研究工作，著重論述應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)控光合作用、淀粉合成、氮素同化和水分利用等代謝途徑提高作物產(chǎn)量的技術(shù)策略和研究現(xiàn)狀，以及這一研究領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)和應(yīng)用前景。分子靶標(biāo)的

27、確定作物產(chǎn)量是一個(gè)復(fù)雜農(nóng)藝性狀，與植株光合效率、養(yǎng)分吸收利用能力、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速度和抵御飾的分子靶標(biāo)是應(yīng)用代謝基因工程培育作物高產(chǎn)品種首先要解決的問題。現(xiàn)在進(jìn)行的許多植物轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，對植物代謝進(jìn)行有效調(diào)控是一道很復(fù)雜的工序。植物體內(nèi)代謝不僅具有可塑性，而且各途徑之間相互影響，錯(cuò)綜復(fù)雜。因此，在確定基因修飾的分子靶標(biāo)時(shí)，常需要考慮幾個(gè)關(guān)鍵的問題。第一，某種代謝產(chǎn)物可能是不同分支代謝的底物，也可能是看上去并無聯(lián)系的其它代謝途徑酶的效應(yīng)分子。這樣，改變某一代謝產(chǎn)物水平可能會對整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生影響。第二，不同的酶可催化相同的反應(yīng)，這使得植物能夠補(bǔ)償由于某個(gè)酶的遺傳修飾而造成的代謝變化。或者說，即使通過

28、基因操作使某種目標(biāo)酶表達(dá)量大幅度削減也不會給代謝帶來明顯的影響。第三，植物可以通過甲基化作用和RNA干涉等機(jī)制使導(dǎo)入的目標(biāo)基因發(fā)生完全或部分沉默，從而阻止或降低了轉(zhuǎn)基因?qū)δ繕?biāo)代謝過程的影響。依據(jù)對植物代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識，通過對影響代謝產(chǎn)物分配的主要因素(酶基因及其調(diào)節(jié)因子)及其與作物產(chǎn)量關(guān)系的分析，已經(jīng)確立了一些遺傳修飾的分子靶標(biāo)，這些基因參與淀粉合成、植物光合作用、N素吸收和同化、水分利用等植物生理生化代謝過程。對這些分子靶標(biāo)的遺傳修飾已進(jìn)行了許多成功的嘗試，使作物產(chǎn)量有了一定的提高，然而尚未達(dá)到所期望的程度。目前，以提高產(chǎn)量為直接目的的植物代謝遺傳修飾主要集中在“源、流、庫”能力的

29、改良方面，即：通過對“源”組織代謝的調(diào)節(jié)以增加其對“庫”組織的碳源供應(yīng)能力；通過提高“源”“庫”組織之間同化產(chǎn)物的運(yùn)輸能力來促進(jìn)光合產(chǎn)物向“庫”組織的轉(zhuǎn)運(yùn)；通過調(diào)節(jié)“庫”組織的代謝來增加其對光合同化物的利用效率，進(jìn)而增加特定化合物的合成和積累量。淀粉合成的遺傳修飾淀粉是禾谷類糧食作物籽粒和薯類作物塊莖或塊根中的主要儲藏化合物，是人類食用碳水化合物的重要來源。全世界每年來源于水稻、玉米、小麥和馬鈴薯的淀粉超過109噸。增強(qiáng)作物儲藏器官組織中淀粉合成和積累能力一直是常規(guī)育種和基因工程育種的一個(gè)主要目標(biāo)。馬鈴薯具有豐富的適于轉(zhuǎn)化的遺傳資源，較易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化和獲得大量的轉(zhuǎn)基因株系。因此，馬鈴薯已成為人

30、們研究與產(chǎn)量相關(guān)代謝的生化特征以及代謝調(diào)控的模式植物。淀粉主要在質(zhì)體中合成。葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)和葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)進(jìn)入質(zhì)體后，在ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶(AGPase)催化下，G-1-P和ATP形成腺苷二磷酸一葡萄糖(ADP-glucose)。ADP-葡萄糖是淀粉合成酶的底物和淀粉合成的前體物質(zhì)。早期研究中，遺傳操作提高淀粉合成的首選策略是增加ADP-葡萄糖含量。這可通過遺傳修飾AGPase酶的特性來增加ADP葡萄糖的水平，也可以通過改變這種酶的已知變夠效應(yīng)物的水平，或者提高ADP葡萄糖上游代謝物己糖磷酸酯來達(dá)到此目的。這些遺傳修飾策略雖然使轉(zhuǎn)基因植株的代謝發(fā)生較大改

31、變，但其中只有對AGPase酶特性的遺傳修飾后成功地提高了ADP-葡萄糖含量，進(jìn)而使玉米籽粒和馬鈴薯塊莖中淀粉合成和積累增加。Tjaden等和Loef等研究報(bào)道，質(zhì)體中腺苷酸含量的水平對淀粉合成非常重要。馬鈴薯塊莖中質(zhì)體ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與淀粉含量的變化相關(guān)，質(zhì)體ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)導(dǎo)致了塊莖中淀粉水平的提高。然而，對該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的反義抑制則減少了塊莖中淀粉積累。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，用腺苷酸溶液培養(yǎng)馬鈴薯塊莖引起細(xì)胞中腺苷酸庫增加，結(jié)果最終導(dǎo)致塊莖中淀粉合成速率的提高。腺苷酸激酶催化ATP，AMP和ADP的轉(zhuǎn)化，它是維持各種腺苷酸平衡的關(guān)鍵酶。因此，腺苷酸激酶就成為調(diào)控腺苷酸庫大小

32、的靶標(biāo)分子。Regierer等通過對質(zhì)體腺苷酸激酶基因修飾而減低該酶的活性，結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)塊莖中腺苷酸含量的增加。與非轉(zhuǎn)基因的對照相比，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系塊莖中淀粉含量增加了60，塊莖產(chǎn)量增加39。不僅如此，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中一些氨基酸的含量也高于野生型馬鈴薯。這是迄今通過基因修飾技術(shù)使馬鈴薯塊莖淀粉含量增加最多的一例，也是最成功的一例，并且建立了一種通過基因修飾調(diào)節(jié)參與目標(biāo)代謝的輔助因子含量來增加產(chǎn)量的新技術(shù)策略。與常用的通過增加目標(biāo)代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)含量最終提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的策略不同，該策略所修飾靶標(biāo)是作為輔助因子的代謝物，這些輔助因子不僅參與目標(biāo)代謝反應(yīng)，還參與更多的其它生化反應(yīng)。Smid

33、ansky，E.D等人近來報(bào)道了導(dǎo)人玉米shrunken2基因的轉(zhuǎn)基因小麥的分析結(jié)果。玉米shrunken2基因編碼葡萄糖焦磷酸化酶的一個(gè)大亞基，該亞基可降低其對負(fù)變構(gòu)效應(yīng)物正磷酸鹽的敏感性。與野生型相比，轉(zhuǎn)入該基因的小麥平均每株種子重量提高38。這可能是由于腺苷二磷酸葡萄糖含量的改變引起的，但是也不能排除該轉(zhuǎn)基因?qū)Φ矸酆铣善渌富虼x的多效性的影響。這種產(chǎn)量提高的原因被認(rèn)為是由于淀粉合成的增加所帶來的庫強(qiáng)的提高。須注意的是，這可能是基因型特異反應(yīng)的一個(gè)特例。因?yàn)樵S多已有的試驗(yàn)都表明，庫強(qiáng)的提高未能自動(dòng)地增加馬鈴薯的產(chǎn)量。另一個(gè)例子是，對線粒體途徑的基因修飾出乎意料地增加了塊莖中淀粉的含量，轉(zhuǎn)

34、基因植株比野生型增加了45，但并沒有影響到塊莖的總產(chǎn)量。這些研究工作預(yù)示著，如果我們能夠確定適當(dāng)?shù)倪z傳修飾靶標(biāo)，那么通過代謝基因工程提高作物產(chǎn)量具有良好的前景。然而，由于現(xiàn)有分析工具的局限性，我們對轉(zhuǎn)基因效應(yīng)的闡述是有限的。通常情況下，僅能夠?qū)σ恍╆P(guān)鍵代謝組分的專一性遺傳操作效果作出評價(jià)。例如，輔因子庫等可調(diào)控多種復(fù)雜的靶標(biāo)，作用于代謝途徑的許多方面，對上述轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊莖產(chǎn)量提高的解釋就不能明確它是腺苷酸激酶活性降低的直接結(jié)果還是間接結(jié)果。對這些因果機(jī)制的準(zhǔn)確認(rèn)識的缺陷導(dǎo)致我們很難評價(jià)出對同一靶標(biāo)的基因操作是否能在不同作物品種及種間產(chǎn)生相同的效應(yīng)。光合作用的遺傳修飾提高植物光合速率是光合作

35、用代謝途徑基因修飾的一個(gè)主要目標(biāo)。長期以來人們一直希望能將C4高光合特性導(dǎo)入C3植物以提高它們的光合效率。C4光合途徑的關(guān)鍵酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)和丙酮酸乙磷酸雙激酶(PPDK)。將C4植物玉米的PPDK基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，轉(zhuǎn)基因植株的PPDK活性比對照高5.4倍。將整個(gè)玉米的PEPC基因轉(zhuǎn)入C3植物水稻，獲得了高水平表達(dá)玉米PEPC的轉(zhuǎn)基因水稻植株，PEPC活性比對照高110倍。已有的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的C4酶活性，雖然高于C3對照植株，但還是遠(yuǎn)低于C4植物中的酶活性。迄今還沒有所獲得轉(zhuǎn)移C4光合途徑提高產(chǎn)量的例證。看來C4酶只有與C4植物特

36、有的高效固定C02的細(xì)胞組織及路徑相結(jié)合才能發(fā)揮其高光合效能。核酮糖-1，5二磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)是固定C02反應(yīng)的限速酶，改進(jìn)該酶的活性尤其是對C02的親和性，就能提高植株的光合速率。Rubisco由大亞基(rbcL)和小亞基(rbcS)組成。大亞基由葉綠體基因rbcL編碼，小亞基由核基因rbcS編碼。向日葵(Helianthusannuus)植物Rubisco的C02親和性最高，比煙草約高10。將向日葵的rbcL基因?qū)霟煵萑~綠體，轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體合成了由8個(gè)向日葵大亞基和8個(gè)煙草小亞基組裝成的十六聚體雜種Rubisco。雜種Rubisco對C02親和性增加，但沒有高到向日葵

37、Rubisco對C02親和性，而且易于解體。所以這些轉(zhuǎn)基因煙草植株光合效率沒有提高。這可能是向日葵Rubisco大亞基和煙草Rubisco小亞基親和性底的緣故。光合細(xì)菌Phodospirillumrubrum的Rubisco僅由一個(gè)基因rbcM,為同源二聚體。將rbcM導(dǎo)人煙草葉綠體，轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體沒有形成雜種Rubisco，R.rubrum的Rubisco則大量生成，且具有原R.rubrum同樣的C02親和性。在C02富集的條件下，轉(zhuǎn)基因煙草植株才能正常生長。這些對Rubisco進(jìn)行分子修飾的探索為光合作用改進(jìn)積累了經(jīng)驗(yàn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，有可能將向日葵編碼Rubisco大小亞基的基因全部導(dǎo)

38、入其它低光效的大田作物，使其產(chǎn)量提高。人們還對其它參與光合作用的酶及輔助因子進(jìn)行基因修飾，以提高植物的光合效率。光合作用所固定的CO2經(jīng)Calvin循環(huán)后要迅速用于合成淀粉等碳水化合物，才能保證光合作用順利進(jìn)行。加速Calvin循環(huán)產(chǎn)物通向終產(chǎn)物合成，就可提高光合速率。果糖-1，6-二磷酸酶所催化的反應(yīng)正是光合產(chǎn)物離開Calvin循環(huán)進(jìn)入終產(chǎn)物合成的分支點(diǎn)，因此，F(xiàn)BPase就成為基因修飾的分子靶標(biāo)。將從藍(lán)細(xì)菌分離的FBPase基因?qū)霟煵?，使其在葉綠體中表達(dá)。在含360ppmCO2空氣條件下，轉(zhuǎn)基因植株的光合效率和生長均明顯提高，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因植株的干物質(zhì)和CO2固定率分別增加1

39、.5倍和1.24倍，Rubisco活性提高了1.2倍，Calvin循環(huán)中間產(chǎn)物及碳水化合物積累均比對照增多。這是第一個(gè)關(guān)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)單個(gè)質(zhì)體靶標(biāo)酶提高受體植株碳同化率和生長的報(bào)道，展示了通過轉(zhuǎn)基因調(diào)控光合作用提高作物產(chǎn)量的可行性和有效性。氮同化的遺傳修飾植物吸收氮的多少和氮利用效率高低對產(chǎn)量有重要影響。結(jié)合應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和生理生化分析，人們對植物生長發(fā)育過程中氮吸收，同化和再利用的分子控制機(jī)理的認(rèn)識愈來愈深入。谷氨酰胺合成酶(GS)，谷氨酸合酶(GOGAT)，谷氨酸脫氫酶(GDH)是參于高等植物氮同化代謝的主要酶。GS可分為兩類，分別主要存在于光合組織的質(zhì)體和根細(xì)胞的胞質(zhì)中。質(zhì)體GS由一個(gè)基因

40、編碼，胞質(zhì)GS由一個(gè)多基因家族編碼。質(zhì)體GS同化硝酸還原和光呼吸所產(chǎn)生的氨，而胞質(zhì)GS主要同化植物根系統(tǒng)中硝酸還原作用產(chǎn)生的氨。GOGAT亦分為兩類，其組成，分子量，還原特異性和功能明顯差異。依賴鐵氧還蛋白的GOGAT(Fd-GOGAT)，主要存在與葉組織細(xì)胞質(zhì)體中，參與光誘導(dǎo)的生哩過程；NADH-GOGAT則存在于非光合組織中，與Gs一起同化銨。在銨的再利用中起重要作用的GDH，亦分為兩種類型，即存在于線粒體的NADH-依賴型和存在于葉綠體的NADPH-依賴型。用玉米重組近交群體進(jìn)行QTL作圖發(fā)現(xiàn)，一些控制產(chǎn)量的QTL與3個(gè)胞質(zhì)GS基因位于相同基因組區(qū)間，說明GS催化的氮同化反應(yīng)步驟對產(chǎn)量有

41、重要貢獻(xiàn)?，F(xiàn)已對這幾個(gè)酶進(jìn)行了許多基因操作，以改進(jìn)氮同化效率，提高作物產(chǎn)量。胞質(zhì)GS在大豆根中超表達(dá)，總GS活性增加10%30%，總氨基酸含量明顯提高，但植株生長和形態(tài)沒有變化。大豆胞質(zhì)GS在蓮植物中組成性超表達(dá)，葉中總GS活性增加50%80%，根中GS活性則沒變化，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育加快，開花提前和早衰。若將大豆胞質(zhì)GS在豆科植物根瘤中表達(dá)，植株莖和根的生物量提高2倍。煙草質(zhì)體GS基因在大豆葉組織中超表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化葉中質(zhì)體GS活性提高2倍，銨庫量減少4倍，谷氨酸和谷氨酰胺含量增加。葉蛋白總量和表型沒有改變。反義胞質(zhì)GS基因在煙草韌皮部表達(dá)，植物體中胞質(zhì)GS的mRNA減少20%30%，根和韌皮部銨

42、含量增加25倍，而質(zhì)體GS和植株表型沒有變化。超表達(dá)反義Fd-GOGAT基因的煙草，F(xiàn)d-GOGAT活性降低60%，引起銨毒癥。小麥的胞質(zhì)GS1基因在植株體內(nèi)銨的再利用或稱中起關(guān)鍵作用，超表達(dá)GS1基因的小麥葉片，GS1活性增強(qiáng)，氮在體內(nèi)尤其在籽粒中積累增多，根部和籽粒干重也提高，展示出小麥氮同化代謝遺傳改良的良好前景。超表達(dá)各種GDH基因的轉(zhuǎn)基因植物，不僅生長量提高，而且脅迫耐性也增強(qiáng)，進(jìn)一步需在大田條件下，驗(yàn)證這些有利表型變化?？梢?，通過對氮同化代謝的遺傳修飾提高作物產(chǎn)量還需作更深入的研究。水分利用率的遺傳修飾在大多數(shù)情況下，水分利用率低是作物產(chǎn)量的限制因素，因此多年以來它一直是遺傳改良的

43、靶標(biāo)。改良植物細(xì)胞抗?jié)B透脅迫的能力是提高植物水分利用率的一個(gè)可行途徑。現(xiàn)已克隆了許多抗(耐)滲透脅迫的基因，對這些基因進(jìn)行遺傳修飾，提高植物水分利用率也已取得一定的進(jìn)展。例如，海藻糖是一種可溶性的小分子化合物，在細(xì)胞中積累可提高滲透勢，對蛋白質(zhì)，膜系統(tǒng)有很好保護(hù)作用。將酵母催化海藻糖形成的基因海藻糖-6磷酸合酶基因TPS1在煙草葉綠體中超表達(dá)，海藻糖含量增加了20多倍，抗?jié)B透脅迫能力增強(qiáng)，水分利用率也明顯提高，這為進(jìn)一步應(yīng)用于提高大田作物抗旱性和產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用其它一些基因進(jìn)行分子操作改良植物水分脅迫耐性也取得了不少成功的經(jīng)驗(yàn)。未來需要進(jìn)行更全面更復(fù)雜的生理生化研究，建立相應(yīng)的技術(shù)體系，以使在實(shí)驗(yàn)室獲得抗脅迫的植株能繼續(xù)在大田脅迫條件下保持和遺傳這種改良的特征。前景與展望通過代謝基因工程提高作物產(chǎn)量的潛力還尚未被充分認(rèn)識和挖掘出來。雖然已有轉(zhuǎn)基因提高作物產(chǎn)量的例證，但是目前仍然未能確定這些代謝遺傳操作提高作物產(chǎn)量的真正機(jī)制。由于分析工具和水平的缺陷，基于目前的生化知識對這些代謝基