葡聚糖凝膠柱的使用方法

1、葡聚糖凝膠柱的使用方法葡聚糖凝膠柱的使用方法：（1） 預(yù)處理稱(chēng)取Sephadex G-25（50,100目）約5g,加入蒸儲(chǔ)水100ml,置室溫下3h進(jìn)行 溶脹。（2）裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為 1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞 塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200目尼龍布）墊底或購(gòu)買(mǎi)類(lèi)似規(guī)格的商品柱。然后將柱 垂直安裝好，先加入1/3柱體積蒸儲(chǔ)水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入， 使它們?cè)谥鶅?nèi)自然沉降。同時(shí)大開(kāi)下口慢速流出蒸儲(chǔ)水。裝柱后的凝膠必須均勻， 不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝，裝好后，用蒸儲(chǔ)水平衡 2,3h即可 加樣品分離。（3）加樣加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上

2、面多余的蒸儲(chǔ)水放出，直到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊（或留一極薄液層）為止。然后，由柱的上端加水解液 2ml,注意不要讓溶液把凝 膠沖松浮起，加完樣品后，打開(kāi)下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量 蒸儲(chǔ)水沖洗原來(lái)盛樣品的容器2,3次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。（4）洗脫與收集洗脫時(shí)，用蒸儲(chǔ)水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定 的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。本實(shí)驗(yàn)洗脫液流出的速度應(yīng)控制在 0.8,1.0ml/min 。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集3ml,共收集10管。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，4或5號(hào)管核甘酸濃度最大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋?長(zhǎng)度的差異，管號(hào)

3、會(huì)有變化，必要時(shí)可用紫外檢測(cè)A260nm找出濃度最大的管號(hào)。(5) 凝膠的再生和回收凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要 再生處理。用 0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實(shí)驗(yàn)完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60?烘箱中烘干，回收保存。實(shí)驗(yàn)五 . 葡聚糖凝膠層析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。2( 學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】凝膠層析又稱(chēng)分子排阻層析或凝膠過(guò)濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為

4、純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是: 具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠(Sephadex) 和瓊脂糖凝膠 (Sepharose) 。葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3氯1， 2環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過(guò)調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來(lái)控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密 ; 交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬(wàn)不等。葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過(guò)葡聚糖凝膠層析柱，各個(gè)組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到

5、的阻滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動(dòng)。分子量大于允許進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)完全被凝膠排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動(dòng)，因此流程短，而先流出層析柱; 分子量小的物質(zhì)可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長(zhǎng)，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩 者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。本實(shí)驗(yàn)以葡聚糖凝膠G 25 作為固定相載體，來(lái)分離藍(lán)色葡聚糖 2000 和溴酚藍(lán)。藍(lán)6色葡聚糖一2000分子量接近2X10,而澳酚藍(lán)分子量為670,二者分子量相 差較大，前者完全排阻，而后者則可完全進(jìn)入凝膠顆粒網(wǎng)

6、孔內(nèi)，二者通過(guò)層析柱的時(shí)間不同而分開(kāi)。 【實(shí)驗(yàn)材料】實(shí)驗(yàn)器材層析柱(1 X 20cm)附有一小段乳月$管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1);試管及試管架；量筒10m1;721型分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)試劑Tris 一醋酸緩沖液(pH7.0):取 0.0lmol/L Tris 溶液(含 0.1mol/LKCl)900ml,用濃醋酸調(diào)pH至7.0,加蒸儲(chǔ)水至1000m，溴酚藍(lán)溶液: 稱(chēng)取溴酚藍(lán)10 毫克，溶于5 毫升乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，然后逐滴加入Tris 醋酸緩沖液(pH7.0) 至溶液呈深藍(lán)色。藍(lán)色葡聚糖 2000溶液 : 稱(chēng)取藍(lán)色葡聚糖 2000 10 毫克，溶于 2 毫升Tris

7、 醋酸緩沖液(pH7.0) 中即成。樣品溶液 : 取溴酚藍(lán)溶液0.1 毫升，藍(lán)色葡聚糖 2000溶液 0.5 毫升混勻后為上柱樣品溶液。葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex-G-25)【實(shí)驗(yàn)操作】實(shí)驗(yàn)?zāi)z的制備: 商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，稱(chēng)取 4 克葡聚糖凝膠G 25，加50 毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6 小時(shí)，或沸水浴溶脹 2 小時(shí)，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，再以緩沖溶液（pH7.0 的 Tris 醋酸溶液）洗滌23次，使pH和離子強(qiáng)度達(dá)到平衡，最后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，凝膠可保存在緩沖液內(nèi)。裝柱 : 將層析

8、柱洗凈，垂直固定在鐵支架上，選擇有薄膜端作為層析柱下口，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊。層析柱中加入洗脫液，打開(kāi)下口螺旋夾，讓溶液流出，排除殘留氣泡，最后保留約 2 厘米高度的洗脫液，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動(dòng)均勻，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中，待凝膠沉積到柱床下已超過(guò) l 厘米時(shí)，打開(kāi)下口螺旋夾，繼續(xù)裝柱至柱床高度達(dá)到 8 厘米 , 關(guān)閉出口。裝柱過(guò)程中嚴(yán)禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完，避免出現(xiàn)分層。再用洗脫液平衡l 至 2 個(gè)柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液。平衡后，擰緊下端螺旋夾。加樣品 : 打開(kāi)螺旋夾使柱面上的洗脫液流出，直至床面與液面剛好平齊為止，關(guān)閉下端出口。取溴酚藍(lán)及藍(lán)色

9、葡聚糖 2000混合液 0.3 毫升，小心地加于凝膠表面上，切勿攪動(dòng)層析柱床表面。打開(kāi)下端出口，使樣品溶液進(jìn)入凝膠內(nèi)，并開(kāi)始收集流出液。當(dāng)樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時(shí)，關(guān)閉下端出口。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次，每次清洗液應(yīng)完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)后，再進(jìn)行下一次洗滌。最后在凝膠表面上加入洗脫液，保持高度為34cm。洗脫與收集: 連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘 1 毫升，進(jìn)行洗脫。仔細(xì)觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象，收集洗脫液，每收集3 毫升即換一支收集管 （ 試管預(yù)先編號(hào)） ，收集約 20 管左右，樣品即可完全被洗脫下來(lái)。將各收集管中的洗脫液分別用 721型分光光度計(jì)在波

10、長(zhǎng)540nm處測(cè)定其光密度。凝膠回收處理方法 : 將樣品完全洗脫下來(lái)后，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開(kāi)，再將上口慢慢松開(kāi)，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。Sephadex LH20 的原理。Sephadex LH20 的分離原理主要有兩方面: 以凝膠過(guò)濾作用為主，兼具反相分配的作用 （ 在反相溶劑中 ） 。因?yàn)槟z過(guò)濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留強(qiáng)，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫， SephadexLH20對(duì)化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗

11、脫，這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。Sephadex LH20 洗脫溶劑?？赐甑?2 點(diǎn)后，就應(yīng)該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類(lèi): 反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫，以甲醇, 水系統(tǒng)最為常見(jiàn)，先用水，逐漸增加甲醇比例，最后用 100, 甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿, 甲醇最為常見(jiàn)，先用 50, 氯仿, 甲醇，逐漸增加甲醇比例，最后用 100, 甲醇沖柱。Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（ 甲醇 , 水） ，樣品用最少體積的甲醇,水（盡可能甲醇少一些）溶解，過(guò)濾后，濕法上樣（一定要濾喔要是把SephadexLH20 堵

12、啦，就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去，很心痛呀） 。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿 , 甲醇 ） ，樣品用最少體積的氯仿, 甲醇溶解，過(guò)濾后，濕法上樣。Sephadex LH-20 的步驟。選擇條件 :梯度洗脫在Sephadex 使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng); 極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。飽和層析柱:用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打開(kāi)開(kāi)關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗

13、脫劑中。樣品處理 : 用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過(guò)濾。濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。洗脫 : 控制流速，一般 1drop/s 以下，可參見(jiàn)廠(chǎng)家的一些參數(shù); 必要時(shí)更改極性 ( 很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢) 。再生以備下次使用。分離的技巧，最后說(shuō)說(shuō)我的使用心得流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達(dá)。柱子盡可能長(zhǎng)， Sephadex LH20 柱長(zhǎng)的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優(yōu)勢(shì)兵力，打擊敵人。 (3) 餾分一定要接的細(xì)，可1,10 ，或 1,20 個(gè)保留體積接成一餾分。 (4) 洗脫體積一般為 2-3 個(gè)

14、保留體積，對(duì)特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫5 個(gè)保留體積。 (5) 鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，如不在乎填料者，可用 Sephadex LH20分鞣質(zhì) (6)Sephadex LH20 對(duì)黃酮類(lèi)成分的分離效果極佳，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。 (7) 填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái)，待用。Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如 : 類(lèi)固醇、萜類(lèi)、脂類(lèi)以及小分子多肽等， Pharmadex LH-20 同時(shí)適用于分子類(lèi)別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于

15、初步純化步驟，也可用于最終精制步驟，如非對(duì)映同分異構(gòu)體的分離。裝柱裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（ 粒徑分布越窄 ） ，越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對(duì)于 Sephadex LH-20 而言，25,100 rn的粒徑范圍相對(duì)于許多用于制備色譜的填料而言，不能說(shuō)分布均一，也就是說(shuō)其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對(duì)容易得到均一的柱床。這對(duì)于長(zhǎng)柱（最高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲(chǔ)槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。Sephadex LH-20 在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過(guò)程中，要盡量避免過(guò)分?jǐn)嚢?，否則會(huì)破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請(qǐng)參考后頁(yè)之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過(guò)1.5ba 。平衡上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線(xiàn)變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?/p>