Fn、HSP70在冠心病猝死心肌中表達(dá)的診斷意義

1、Fn、HSP70在冠心病猝死心肌中表達(dá)的診斷意義 作者：孫忠國 張凡 成日青 張九鴻【摘要】 目的： 探討冠心病猝死心肌組織Fn、HSP70染色改變，為法醫(yī)學(xué)鑒定冠心病猝死提供客觀依據(jù)。方法： 選擇35例冠心病猝死案例、30例冠心病死亡案例以及32例非冠心病死亡案例，用免疫組化方法對比檢測纖維連接蛋白（Fibronectin Fn）和熱休克蛋白70（heat shock protein70 HSP70）的表達(dá)。結(jié)果： 纖維連接蛋白在35例冠心病猝死案例、冠心病死亡案例以及非冠心病死亡案例中均有不同程度的陽性表達(dá)，且冠心病組的表達(dá)水平明顯高于冠心病猝死組和非冠心病死亡組（P0.05）；冠心病猝死

2、組的表達(dá)水平明顯高于非冠心病死亡組（P0.05）；HSP70在冠心病猝死案例、冠心病死亡案例組呈陽性表達(dá)，冠心病組表達(dá)水平明顯高于冠心病猝死組（P0.05），非冠心病死亡組均呈陰性表達(dá)；Fn在冠心病猝死組中的表達(dá)與HSP70呈明顯正相關(guān)（P0.05）。結(jié)論： 纖維連接蛋白和HSP70的陽性表達(dá)是心肌缺血和損傷的靈敏指標(biāo)，對推斷冠心病猝死具有一定的實際應(yīng)用價值。 【關(guān)鍵詞】 冠心病猝死；纖維連接蛋白；熱休克蛋白70；免疫組織化學(xué) 【ABSTRACT】 Objective: To investigate the change of Fn HSP70s expressions in sudden c

3、oronary death and search for reasonable basis for forensic pathology to diagnose sudden coronary death.Methods: The expressions of Fn、HSP70 proteins were detected by immmunohistochemistry method in thirtyfive cases died of sudden coronary death、thirty cases died of coronary heart disease and thirtyt

4、wo cases died of disease.Results: All cases have various level expression of Fn and the expression level of coronary heart disease is higher than that of sudden coronary death among nosudden coronary death（P0.05）;the expression level of sudden coronary death is higher than that of nosudden coronary

5、death（P0.05）;HSP70 have positive expresssion only in sudden coronary death and coronary heart disease The expression of HSP70 in coronary heart disease is higher than that of sudden coronary death. There is positive correlation between the expression of HSP70 and Fn in sudden coronary death.Conclusi

6、on: Fn and HSP70 are sensitive index to myocardiums injury and anemic so they have practical value for forensic pathology to diagnose sudden heart death. 【KEY WORDS】 Sudden Coronary Death; Fn; HSP70; Immunohistochemistry 猝死者往往預(yù)先沒有任何征兆或癥狀和體征極輕微，死亡意外而且突然，無有醫(yī)生在場，因此易引起懷疑，而冠心病是猝死的常見原因，常規(guī)病理學(xué)方法觀察缺乏典型的形態(tài)學(xué)依據(jù)

7、，給冠心病猝死的診斷增加了難度，目前基層法醫(yī)工作者對冠心病猝死的鑒定主要還是依賴于排除法，即在排除暴力、中毒及其他疾病致死的基礎(chǔ)上，結(jié)合冠狀動脈明顯的粥樣硬化斑塊病變作出冠心病猝死的鑒定。纖維連接蛋白和HSP70是兩個對組織損傷較為敏感的指標(biāo)，在急慢性炎癥過程中都存在陽性表達(dá)，而且冠心病猝死心肌的病理變化肯定與長期存在明顯癥狀的冠心病死亡心肌以及非冠心病死亡心肌之間存在不同，因此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測纖維連接蛋白和HSP70在冠心病猝死、冠心病死亡和非冠心病死亡心肌中的表達(dá)，為冠心病猝死提供法醫(yī)學(xué)鑒定客觀依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 尸檢材料 選取近10年來我室受理檢驗的312起案件的

8、97個心臟標(biāo)本，冠心病猝死35例，男性25例、女性10例，年齡3560歲；冠心病死亡30例，男性18例、女性12例，年齡4568歲；非冠心病猝死32例，男性15例、女性17例，年齡27歲58歲；心臟重量為396.0979.35g，左心室壁厚1.480.25cm，右心室壁厚0.480.12cm。根據(jù)心臟大體解剖和HE染色觀察結(jié)果，參照1995年美國心臟病學(xué)會動脈粥樣硬化病變委員會的分型1,2，將97例心臟標(biāo)本按病變程度不同分為型16例（其中冠心病猝死12例，非冠心病猝死4例），型20例（冠心病猝死9例，冠心病死亡1例，非冠心病猝死10例），型25例（冠心病猝死9例，非冠心病猝死10例，冠心病死亡

9、6例），型18例（冠心病猝死5例，非冠心病猝死5例，冠心病死亡8例），型11例（冠心病死亡10例，非冠心病猝死1例），型7例（冠心病6例，非冠心病猝死1例）。尸檢均在死亡后12h內(nèi)進(jìn)行。 1.2 實驗方法及試劑 每例心臟標(biāo)本沿血流方向剖開，10%甲醛固定23d后于心尖、左心室前壁、后壁和側(cè)壁、室間隔、竇房結(jié)、房室結(jié)處各取一組織塊，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚4m，分別進(jìn)行HE染色、Fn、HSP70免疫組織化學(xué)染色。 HSP70抗體為美國Sigma公司產(chǎn)品，克隆編號：BRM2；Fn抗體購自福建邁新試劑公司，單克隆抗體，二抗、三抗為SP復(fù)合物和山羊抗兔PV6001，購自北京中山試劑公司，按說明書嚴(yán)格

10、進(jìn)行操作，用試劑公司提供陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。 1.3 主要免疫組化步驟 二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1h DAB顯色1015min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。 1.4 陽性表達(dá)圖象分析 采用HIPAS100圖象分析軟件對所有切片進(jìn)行圖象分析，每張切片隨機(jī)選取5個著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場，測量每個視場中陽性單位，取其均數(shù)即為該切片的表達(dá)水平，所有的結(jié)果都以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。 1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。不同組間表達(dá)率的比較采用Fisher精

11、確概率法，各指標(biāo)表達(dá)水平比較用t檢驗。 2 結(jié)果 2.1 HE染色觀察 冠心病死亡組心肌細(xì)胞顆粒變性，出現(xiàn)收縮帶，心肌細(xì)胞壞死纖維化，急性心肌梗死者，可見局部出血或淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，陳舊性梗死纖維瘢痕形成。冠心病猝死組心肌肥大變性，嗜伊紅性強(qiáng)，細(xì)胞漿聚集呈顆粒狀或細(xì)胞漿溶解呈空泡化，細(xì)胞核增大，染色質(zhì)疏松。非冠心病猝死組型1例，型1例出現(xiàn)心肌細(xì)胞顆粒變性和陳舊性梗死纖維瘢痕形成外，其余病理變化同冠心病猝死組無明顯組織學(xué)區(qū)別。 2.2 纖維連接蛋白及HSP70免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Fn及HSP70的陽性部位均為細(xì)胞漿。Fn在非冠心病猝死組、梗死組和猝死組的陽性表達(dá)率分別為11%（4/32

12、）、95%（28/30）、77%（27/35），在各組標(biāo)本中均有表達(dá)，且在非冠心病猝死組的表達(dá)率、表達(dá)水平明顯低于梗死組和猝死組；猝死組表達(dá)率、表達(dá)水平低于梗死組，同時非冠心病猝死組的陽性表達(dá)水平較低，且陽性細(xì)胞的分布沒有明顯規(guī)律，猝死組陽性表達(dá)出現(xiàn)灶性分布特點，在病變動脈供血區(qū)域分布且表達(dá)水平高，而竇房結(jié)、房室結(jié)處未見陽性細(xì)胞，梗死組陽性表達(dá)呈現(xiàn)大片分布的特點，高水平表達(dá)，而且冠狀動脈粥樣硬化區(qū)域周圍的心肌細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，竇房結(jié)、房室結(jié)處心肌細(xì)胞散在陽性（見表1）。表1 纖維粘連蛋白在各組的不同表達(dá)注：*梗死組與猝死組比較；*梗死組與正常對照組比較；*猝死組與非冠心病猝死組比較。 HSP

13、70僅在猝死組和梗死組有陽性表達(dá)，陽性率分別為67%（23/35）和85%（26/30），梗死組的陽性率、表達(dá)水平明顯高于猝死組；同時梗死組的陽性表達(dá)在粥樣硬化動脈嚴(yán)重區(qū)域周圍的心肌細(xì)胞大片狀高水平表達(dá)HSP70，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)周圍的心肌細(xì)胞陽性表達(dá)呈現(xiàn)灶性特點，而在猝死組的陽性表達(dá)僅存在于粥表2 HSP70在各組的不同表達(dá) 3 討論 冠心病猝死的的主要病理改變?yōu)楣跔顒用}粥樣斑塊形成和心肌梗死，冠脈粥樣硬化病變的總檢出率以前降支最高，而且分布規(guī)律是左心多于右心，近端多于遠(yuǎn)端；目前法醫(yī)病理學(xué)對冠心病猝死的鑒定主要還是依賴于排除機(jī)械損傷、中毒及其他疾病致死的基礎(chǔ)上，結(jié)合冠狀動脈明顯的粥樣硬化斑塊病變

14、作出冠心病猝死的鑒定，對冠狀動脈病變較輕甚至形態(tài)正常的猝死，除外其它死因并高度懷疑冠心病猝死的案例診斷往往因為沒有客觀依據(jù)而十分困難，為尋找冠心病猝死的佐證我們選取確診的冠心病猝死案例并與非猝死的冠心病案例、非冠心病猝死案例進(jìn)行Fn和HSP70免疫組化對比染色，實驗結(jié)果顯示Fn與HSP70陽性表達(dá)對冠心病猝死的診斷有肯定意義。 Fn是機(jī)體內(nèi)存在于血漿和細(xì)胞外基質(zhì)的一種大分子糖蛋白，在心肌缺血、梗死過程中心肌細(xì)胞膜損害致通透性增高，血漿中Fn成分首先通過受損的毛細(xì)血管進(jìn)入組織間隙，然后向受損的心肌細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散。有報道心肌發(fā)生缺血15min后在心肌細(xì)胞漿中即可出現(xiàn)Fn陽性反應(yīng)3；Thornell等采

15、用豬作動物模型，發(fā)現(xiàn)在心肌缺血30minFn即可在心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)，并用電鏡證實Fn陽性的心肌細(xì)胞已發(fā)生不可逆損傷4,5。我們實驗的35例冠心病猝死案例中，16例Fn染色心內(nèi)膜下至心肌全層心肌細(xì)胞均有陽性表達(dá)，包括血管平滑肌和乳突肌陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，同時實驗顯示正常組表達(dá)水平低于梗死組和猝死組，推測可能這是由于冠狀動脈粥樣硬化病變引起的管腔狹窄或阻塞導(dǎo)致的冠狀動脈供血區(qū)心肌細(xì)胞缺血、壞死，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞游走滲出到該區(qū)域，發(fā)生了不可逆性損傷，屬較為經(jīng)典的冠心病心肌梗死猝死案例；而且猝死組表達(dá)水平低于梗死組，可能由于機(jī)體對動脈缺血的反應(yīng)存在時間依賴性，猝死組機(jī)體對梗死的反應(yīng)時間較為短暫；粥樣硬

16、化周圍區(qū)域出現(xiàn)陽性表達(dá)而傳導(dǎo)系統(tǒng)周圍散在陽性可能與不同解剖部位的耐受性有關(guān)。 HSP70在正常細(xì)胞中水平較低，一般也檢測不到。近年研究成果表明，不僅在心肌早期缺血再灌流動物模型上可觀察到HSP70的表達(dá)增加，臨床心臟外科術(shù)及冠狀動脈旁路移植術(shù)后也能檢測到HSP70的陽性表達(dá)68，而這些都被證明是心臟手術(shù)后心肌缺血再灌流的結(jié)果。我們實驗中HSP70心內(nèi)膜下弱陽性表達(dá)，而邊緣區(qū)陽性反應(yīng)較強(qiáng)，呈棕黃色陽性著色。這可能是因為冠狀動脈發(fā)生較長時間的痙攣、缺血突然緩解后，心肌的再灌流使心內(nèi)膜下心肌組織損害嚴(yán)重，并出現(xiàn)不可逆性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)難以繼續(xù)合成所致。此時邊緣區(qū)HSP70的陽性表

17、達(dá)增強(qiáng)，則可能是因為此處存在著一定的氧梯度，使該區(qū)心肌處于相對缺氧狀態(tài)，促使局部存活細(xì)胞合成HSP70。這與肖俊輝等在家兔早期心肌缺血再灌流動物模型實驗中所觀察到的基本一致9,10，其中3例冠狀動脈粥樣硬化斑塊和HE染色病理形態(tài)學(xué)變化均不顯著，而既往有典型的心絞痛病史及心肌缺血的心電圖改變而猝死者，纖維連接蛋白免疫組織化學(xué)染色心內(nèi)膜下至心肌全層陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目表達(dá)較多，HSP70免疫組化染色心內(nèi)膜至心肌全層陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目較少表達(dá)。這可能是由于冠狀動脈嚴(yán)重痙攣突然緩解后心肌的再灌流誘發(fā)了致命性心律失常乃至猝死所致。 Fn和HSP70作為心肌早期缺血和缺血再灌流時的敏感的細(xì)胞反應(yīng)指標(biāo)，在我們的實

18、驗中兩者的表達(dá)水平在猝死組中呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，可能二者在冠心病猝死病理變化中起協(xié)同作用，隨病變時間的延長表達(dá)水平明顯提高，能具體反應(yīng)心肌損傷細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制發(fā)揮作用的過程，因而在法醫(yī)病理學(xué)中心肌組織中Fn和HSP70免疫組化觀察對推斷冠心病猝死具有一定的應(yīng)用價值?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Myerburg RD, Kessler KM l.Lifethreatening ventricular arrhythmias in patients with silent myocardial ischemiadue to coronaryartery spasmJ.N EnglJ Med,1992,326

19、（22）:145114552 Nappo A,Varesc C,Rossi L, et al.Sudden cardiac death innonprofessional athletesJ.pathologica,1997,89（5）:5175223 趙子琴主編.法醫(yī)病理學(xué)M.第3版 北京：人民衛(wèi)生出版社,2004 .3703744 Fberhardt F,Mehlhorn K.Structural mrocardial changes after coronary artery surgeryJ.Eur J Cli Invest,2000,30（11）:9389465 Corr PB,Witkowski FX.Potential electrophysiologic mechanisms responsible for dysrhythmias associated with reperfusion of ischemic myocardiumJ.circulation,1983,68（2）:16246 Dapunt OE,Raji MR,Jeschkeit S, et al.Intracoronary shunt insertion prev