產漆酶真菌以及漆酶的研究

1、產漆酶真菌以及漆酶的研究摘要：漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在細菌、真菌、放線菌、植物中都有報道，但報道最多的為真菌，尤其是白腐真菌。漆酶能夠降解環(huán)境中的木質素，在紙漿漂白、廢水處理中意義重大。漆酶通常情況下漆酶含有4個銅原子結合位點，通過電子在這四個銅原子間相互傳遞達到分解底物的目的。漆酶基因的異源表達已經吸引了廣大學者的目光，至今為止，數十種真菌的漆酶基因已經成功在酵母等異源表達系統(tǒng)中表達，我們可以預見漆酶在人類未來的生活中將發(fā)揮重要作用。關鍵詞：漆酶，白腐真菌，銅原子結合，異源表達現如今，環(huán)境污染已嚴重影響了人類的生存，造紙廠、紡織廠排出的廢水則是重要的污染源之一。木質素是使廢水顏色發(fā)黑的

2、主要原因1，倘若在工廠排出廢水前先將木質素出去，將會大大降低廢水的毒性。木質素是由聚合的芳香醇構成的一類物質，存在于木質組織中，是世界上僅次于纖維素的第二位最豐富的有機物。木質素作為纖維素的粘合劑，能增強植物體的機械強度，利于輸導組織的水分運輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。木質素外觀上是一種白色或接近無色的物質，相對密度大約在1.351.50之間，非常堅硬，難溶于各種無機或有機溶劑2。木質素屬天然芳香族高分子聚合物，是一類在自然界存在量很大但是又較難降解的可再生資源，木質素不含易水解的重復單元，因而不受水解酶的攻擊，不僅如此，它還和半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障

3、，使纖維素酶不易與纖維素分子接觸，給纖維素的降解也造成了困難3。因此去木質素成為目前人們面臨的一大難題。白腐真菌降解木質素研究表明，在自然界中，木質素的完全降解是真菌、細菌、放線菌及相應微生物群落共同作用的結果。其中，真菌起主導作用4，某些真菌能夠有效的降解木質素，尤其是白腐真菌(white-rotfungus)可通過一系列的酶促反應實現對木質素的徹底降解。白腐真菌是一類絲狀真菌，分類學上屬于真菌門，絕大多數為擔子菌綱，少數為子囊菌綱。目前，研究最多的是黃孢原毛平革菌、彩絨草蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇等。其中，黃孢原毛平革菌是典型菌種，是研究木質素降解的模式菌，普遍分布于北美，我國尚未發(fā)現

4、。白腐真菌木質素酶系統(tǒng)包括兩類三種4,一類是是能利用H202作電子受體的過氧化物酶類，這類酶包括木質素過氧化物酶(EC1.11.1.13LigninPeroxidase,簡稱Lip)和錳依賴過氧化物酶(EC1.11.1.14ManganesePeroxidase,簡稱MnP)；另一類是利用02作為電子受體的多酚氧化酶類，這類酶稱為漆酶(EC1.10.3.2laccase,簡稱Lac)。以上三種酶各自代表一系列同工酶。木質素過氧化物酶和錳依賴過氧化物酶都是含亞鐵血紅素的糖蛋白，木質素過氧化物酶分子量大約為40kD，錳依賴過氧化物酶的分子量一般在3862.5kD之間，它們的血紅素輔基埋在蛋白質內構

5、成活性中心(錳依賴過氧化物酶的活性中心尚需一個Mn2+和兩個起穩(wěn)定結構作用的Ca2+)；漆酶則是一種以02作電子受體的含有4個銅離子的氧化酶，分子量在6080kD之間。漆酶催化氧化底物的基理漆酶最早由一名日本人發(fā)現，它并非只存在于微生物界，在細菌、植物中也有報道5。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶6，屬于藍色多銅氧化酶家族，能夠氧化多種芳香化合物和其它有機化合物，且副產物只有水，被譽為“綠色酶”。漆酶一般以單體存在，極少情況下會有同源或異源二聚體，以及同源四聚體。通常情況下漆酶含有4個銅原子結合位點，根據其光譜和磁性特征可將其分為三類，I型Cu2+一個，呈藍色，在紫外可見光譜614nm處有特征吸收，

6、II型Cu2+一個，非藍色，沒有特征吸收光譜，111型Cu24+兩個，是耦合的離子對，在紫外可見光譜330nm處有較寬的吸收帶。在三類銅原子中，前兩種是單電子受體，順磁性，可用順磁共振測定，III型Cu24+是反磁性，無法用順次共振檢測。I型Cu2+中心相對獨立，并且都與兩個組氨酸(His)的N和一個半胱氨酸(Cys)的5配位，形成扭曲的四面體結構，其中共價鍵Cu-S(Cys)的配位使漆酶呈現藍色。II型Cu2+和III型Cu24+中心緊密相連形成一個三核銅簇。三核銅簇與8個His配位結合，其中II型銅結合2個His，III型銅結合6個His。當然，并不是所有的漆酶都具有四個銅原子。HisHi

7、sOHCuHisCysHisII型Cu2+和III型Cu24+I型52+漆酶催化底物氧化時刀，I型Cu2+和II型Cu2+首先分別從底物接受一個電子，由二價變?yōu)橐粌r，然后通過分子內的電子轉移，1型Cu2+和II型Cu2+將電子傳遞給III型Cu24+，它們由一價變成二價，111型Cu24+由二價變成一價。當I型Cu2+和II型Cu2+分別再次從底物接受一個電子變成一價時，四個銅離子都是一價，這時漆酶呈還原態(tài)。在有02存在下，還原態(tài)漆酶被氧化。02從I型Cu+和III型Cu22+迅速接受三個電子，生成光活性氧中間體(Cu2O)3+，并失去一分子水，1型Cu+和III型Cu22+由一價變成二價。I

8、I型Cu+再氧化很慢，氧中間體一直與III型Cu22+相連，當它從II型Cu+接受第四個電子還原為水時才脫離III型Cu24+，這時四個銅離子都是二價，漆酶呈氧化態(tài)。這樣，通過四個銅離子的協(xié)同作用，傳遞電子，同時發(fā)生價態(tài)變化，實現漆酶對底物的催化氧化。漆酶的異源表達雖然漆酶的潛在應用價值很廣8，比如在紙張漂白、生物修復、染料脫色、果汁與酒的澄清和紡織品的清潔等，但是由于產量低，價格昂貴，漆酶的工業(yè)應用受到很大的限制。漆酶屬于真菌的第二產物，僅在外界環(huán)境惡劣的情況下才會誘導產生，因此僅憑野生菌生產的漆酶遠遠無法滿足需求。異源表達漆酶基因是個有效的辦法，目前已有多種蛋白通過異源表達的方法投入工業(yè)生

9、產，比如青霉素、蔗糖酶、幾種生長激素等。漆酶異源表達的前提是將其基因克隆出來910，1988年Frohman等首次利用快速擴增cDNA技術從白腐菌Postreatus中克隆到漆酶poxI基因，后來的學者多用RT-PCR技術來獲得漆酶基因；也有學者先建立菌種的cDNA文庫，然后以已知的漆酶基因做探針進行篩選；還有人利用漆酶銅原子結合位點的保守性，設計引物克隆漆酶基因。到現在，30種不同來源的漆酶基因已被克隆和測序。酵母表達系統(tǒng)是目前研究的較為透徹的表達系統(tǒng)，它易于進行分子遺傳操作，能夠對重組蛋白進行翻譯后的加工修飾和分泌表達，具備完善的發(fā)酵方法，重組蛋白表達量高，自身滿足安全需要，已成功生產了多

10、種重組蛋白。酵母也成為重組漆酶的主要表達宿主，Trametessanguinea、Trametesversicolor、MelanocarpusAlbomyces、M.thermophila、Pleurotusostreatus、TrametesVersicolor等產漆酶的菌株的重組基因均被報道在酵母S.cerevisiae中表達。外源漆酶基因在酵母中表達會受很多因素影響，如啟動子、信號肽、漆酶基因、表達菌株型號和發(fā)酵條件等。有報道表明在S.cerevisiae中表達漆酶時采用誘導型啟動子比組成型啟動子能獲得更高的表達量，采用a因子信號肽一般比漆酶本地信號肽得到更好的表達效果；另外，發(fā)酵方式

11、、溫度、pH值等對表達影響很大。其次，絲狀真菌表達系統(tǒng)是另一種用于生產重組蛋白質產品的工具，其優(yōu)勢在于其具有分泌大量胞外蛋白質的能力。目前，真菌漆酶已在黑曲霉(A.niger)、構巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)里氏木霉(T.reesei)中進行了異源表達的研究，最高表達量可達7000U/L。但與酵母表達系統(tǒng)相比，酶活相對較低，為了提高漆酶的表達量，研究者對絲狀真菌表達系統(tǒng)進行了改進，比如選擇來源于絲狀真菌自身的強啟動子構建表達載體，通過構建融合蛋白提高漆酶的分泌水平，或抑制絲狀真菌自身的蛋白酶系統(tǒng)，以降低對異源漆酶蛋白的水解等等。結論生物降解木質素是一種趨勢，利用生

12、物方法漂白紙漿、處理廢水、去除木質素不僅污染小，而且使用效率高，能耗低，雖然其效率受諸多因素的影響，隨著科技的發(fā)展，人類對木質素降解機制的認識越來越清楚，我們有理由相信，漆酶的研究和應用將取得重大進步。參考文獻1DeepakPantAEAlokAdholeya.ConcentrationoffungalligninolyticenzymesbyultrafiltrationandtheiruseindistilleryeffluentdecolorizationJ.WorldJMicrobiolBiotechnol,2009,25:1793-800.王紅.論白腐真菌產木質素降解酶在環(huán)境治理中的

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