生態(tài)毒理學(xué)研究方法課件

1、生態(tài)毒理學(xué)研究方法其中一類研究方法：從復(fù)雜系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)某些環(huán)境要素，研究在此環(huán)境要素條件下，污染物的行為(模擬分析)；利用自然生態(tài)系研究污染物的變化；詳細分析環(huán)境中的樣品，確定污染物定量方法。毒性的影響因素生物因素(1) 生物分類組別(taxonomic group)種屬和個體差異：不同種屬的生物或同一種屬不同個體之間對同一毒物的反應(yīng)差異，原因復(fù)雜，但主體原因是毒物在體內(nèi)代謝差異(包括代謝酶)所致。在進行毒性實驗時，應(yīng)盡可能選擇條件一致的生物以減少個體差異造成的影響。 (2) 年齡階段/機體大小反應(yīng)靈敏度差異。新生和幼年生物通常對毒物較成年生物敏感。新生生物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完全，對有關(guān)的興奮劑

2、敏感性差，而對抑制劑則較為靈敏。新生生物的膜通透性較強，對某些脂溶性神經(jīng)毒物的毒性反應(yīng)較大。經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化后毒性增強的化學(xué)物，對新生和幼年生物毒性較成年低，反之，在體內(nèi)可迅速代謝失活的化學(xué)物，對新生和幼年生物毒性可能較大。(3) 營養(yǎng)與健康營養(yǎng)不足或失調(diào)影響化學(xué)物毒性作用。如蛋白質(zhì)缺乏引起酶蛋白合成減少、活性降低，解毒能力降低，毒性增加。維生素缺乏也有類似情況。健康狀況也有影響。(4) 生物節(jié)律即生物鐘，化學(xué)物的毒性與其進入體內(nèi)發(fā)揮作用的時間有關(guān)。非生物因素(1) 溫度(每增加10C，多數(shù)有毒物的毒性會變化2到4倍)影響方式復(fù)雜。適應(yīng)溫度和實驗溫度。毒性的影響因素適應(yīng)溫度耐受溫度抑制水平(產(chǎn)卵)負

3、載水平(活動生長)致死閾值 5%致死閾值 50%最終初始致死溫度三種毒性終點(死亡、生長、產(chǎn)卵)下的適應(yīng)溫度和耐受溫度的關(guān)系。虛線各自內(nèi)部面積指示耐受區(qū)。毒性的影響因素(2) pH和堿度pH對毒性的影響是多方面的，在酸性條件下(pH5)時，H+自身對水生生物便是致命的。酸對魚生理影響的集成模型如下圖所示：2H+Ca3(PO4)2 3Ca2+2HPO422H+CaCO3 Ca2+CO2+H2OH+CO2+H2OK+Na+ + HPrH+Na+PrH+H+鰓ECFH+NH4NaH+H+HP42H+NH3Ca2+腎骨骼ICFH+HCO3K+HPrH+K+PrK+HP42+NH3H+NH4H2PO4E

4、CF: 外細胞液ICF: 內(nèi)細胞液Pr: 蛋白質(zhì)H+還能影響痕量金屬的毒性，方式為：(1)影響水中的金屬形態(tài)；(2)與金屬競爭生物膜上的表面反應(yīng)位。下圖為天然水中痕量金屬的主要形態(tài)及其轉(zhuǎn)化。毒性的影響因素不穩(wěn)定有機絡(luò)合物穩(wěn)定有機絡(luò)合物游離離子顆粒態(tài)吸附無機絡(luò)合物膠體形態(tài)按操作定義的金屬形態(tài)樣品原始樣品在室溫下風(fēng)干，然后在105C的烘箱中烘干。用瑪瑙研缽研磨后，過尼龍篩，篩選一定孔徑的顆粒。取一定量樣品，按下述方法對金屬進行化學(xué)逐級提?。赫麴s水(W/V1:20, 2h, 25C)液相：水可溶態(tài)固相1M/0.5M MgCl2 (pH=7, W/V=1:20, 2h, 25C)固相液相：離子交換態(tài)1

5、M NaOAc (pH=5.1, W/V=1:20,2h, 25C) 固相固相固相液相：碳酸鹽結(jié)合態(tài)液相：中等可還原態(tài)液相：有機硫化物結(jié)合態(tài)0.04M NH2OHHCl (在25%HOAc中,W/V=1:20, 2h, 96C)液相：殘渣態(tài)30%H2O2+0.02M HNO3 (pH=2, W/V=1:20, 4h, 85C)濃HNO3HClO4HF (8h, 160C)HendersonHasselbach方程式對于弱酸HA H+ + AKa = (H+)(A)/(HA)logKa = log(H+)(A)/(HA)logKa = log(H+) + log(A)/(HA)log(H+) =

6、 logKa + log(A)/(HA)pH = pKa + log(A)/(HA)對于弱堿HB+ H+ + BKa = (H+)(B)/(HB+)logKa = log(H+)(B)/(HB+)logKa = log(H+) + log(B+)/(HB+)log(H+) = logKa + log(B+)/(HB+)pH = pKa + log(B)/(HB+)解離常數(shù)pKa與弱酸和弱堿pH的關(guān)系污染物處于pH變化的水介質(zhì)中，其吸收進入機體內(nèi)在相當(dāng)程度上受pH影響，即在腸胃消化道內(nèi)的酸堿反應(yīng)。由上述關(guān)系，pH影響弱酸和弱堿的水溶解度。此外，pH還能影響親脂金屬形態(tài)的生物有效性，不經(jīng)形成表面絡(luò)

7、合物而穿過細胞膜。(3) 鹽度主要應(yīng)用于鹽度變化明顯得海灣地區(qū)。對大多數(shù)金屬而言，低鹽度會增加毒性。鹽度對金屬生物有效性的影響主要與其形態(tài)有關(guān)。(4) 硬度硬度的主要成份是二價鈣離子和鎂離子。美國環(huán)保局USEPA定義硬度通常以CaCO3等價值。(5) 化學(xué)混合物(isobologram，等熱輻射測量圖)一般地，同一化學(xué)分類的化學(xué)物具有相似的毒性?；旌衔锒拘圆⒎鞘呛唵渭雍完P(guān)系。毒性的影響因素化學(xué)物BLC50化學(xué)物ALC50直接化學(xué)物相加協(xié)同/增強無相互作用無相互作用聯(lián)合毒性行為(中間加和響應(yīng))拮抗作用有毒混合物模型：條目定義化學(xué)物A：96小時LC501mg/L化學(xué)物B：96小時LC50=10mg

8、/L兩者分別按1mg/L和10mg/L加入96小時死亡描述定義50%死亡50%死亡(1) 倍數(shù)比例增加(2) 低于情形(1)(3) 高于情形(1)無相互作用，各自反應(yīng)拮抗作用，混合低于各自相加直接相加低于加和增強作用(6) 溶解有機碳(DOC)溶解有機分子，分子量跨度從低于1000高至100000以上。作為金屬離子的絡(luò)合劑。(7) 脂水分配系數(shù)(化合物的毒性除與其在脂水相的相對溶解度有關(guān)，還與其體液絕對溶解度有關(guān))(8) 電離度(弱酸或弱堿型有機物在體內(nèi)pH條件下，電離度低，非離子行比例高，容易被吸收發(fā)揮毒性)(9) 揮發(fā)度和蒸氣壓(暴露接觸的機率)(10) 分散度(粉塵、煙霧等固態(tài)物質(zhì)毒性與

9、分散度即顆粒粒徑大小有關(guān))(11) 純度(雜質(zhì)：剩余原料、合成副產(chǎn)品、添加劑、賦形劑)(12) 濕度(伴隨高溫時，化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收速率加快)(13) 氣壓顆粒物的作用：食物的重要性氣態(tài)污染物除去呼吸吸入和氣孔/表皮進入植物外，還有兩條基本進入途徑：以溶解態(tài)形式直接通過生物膜傳輸；攝取污染顆粒物質(zhì)(僅對異養(yǎng)生物)。有機污染物孔隙水相和沉積物相之間分配：Cw/Cs=Kocfoc，Koc，foc分別為有機相分配系數(shù)和沉積物有機碳分?jǐn)?shù)。沉積物水，土壤水分配系數(shù)可以由辛醇水分配系數(shù)近似：logKoc=a Kow+b。毒性的影響因素沉積環(huán)境中影響化學(xué)物生物有效性的許多重要過程受沉積物氧化還原條件影響。其中

10、，常處于厭氧環(huán)境的沉積物中硫化物對金屬的作用很大。酸可揮發(fā)性硫化物(acid volatile sulfide, AVS)與酸化過程中同步提取金屬含量的關(guān)系是重要的描述沉積物中金屬生物有效性的指標(biāo)。比率形式：AVS/SEM鄰位間位，但也有例外。由于受體和或酶一般只能與一種旋光異構(gòu)體結(jié)合，產(chǎn)生生物效應(yīng)，化學(xué)旋光異構(gòu)體之間的毒性不同。(9) 有機磷化合物：主要指五價磷有機殺蟲劑。接觸條件(1) 接觸途徑：接觸途徑不同，則吸收、分布不同，其代謝轉(zhuǎn)化、毒性反應(yīng)的性質(zhì)和程度也不同。(2) 溶劑和助溶劑：不同溶劑和助溶劑可加速或減緩毒物吸收、排泄，從而影響其毒性。(3) 毒物濃度和容積：稀釋作用情況不一致

11、，有的濃溶液毒性強，有的則稀釋后反而強。(4) 交叉接觸：不同暴露途徑交叉作用。毒性的影響因素群落種群個體組織細胞群落個體種群組織細胞群落個體種群 組織細胞情形A情形B情形C生態(tài)毒理學(xué)應(yīng)包含各種組織水平上的研究不同類型生物組織水平之間的關(guān)系“嵌套形式”，細胞效應(yīng)即簡單地意味著所有生物水平的效應(yīng)。情形B和C中的豎條紋區(qū)域代表不確定性 (Uncertainty)。低級生物響應(yīng)(如酶活性或免疫響應(yīng)的改變)可能代表從健康反應(yīng)直至壓迫(stress)的廣譜范圍。因此，難以確定這種響應(yīng)和有機體適應(yīng)性的定量關(guān)系。從個體水平響應(yīng)結(jié)果外推至種群或群落水平屬于另一類問題(如情形C)。生態(tài)毒理學(xué)方法學(xué)方法生態(tài)毒理學(xué)

12、研究的特點(1) 研究目標(biāo)：保護多物種的種群和群落免受造成現(xiàn)實或潛在危害有毒物濃度的暴露。(2) 關(guān)注物種：受控于直接實驗法的需要。(3) 鑒定不窮盡性：無法鑒別所有關(guān)心的受試物種。因此，結(jié)果外推程度不確定。有機體在生態(tài)系統(tǒng)中的反應(yīng)與實驗室內(nèi)受控條件下的結(jié)果可能不一致。(4) 受試有機體：尤其指水生生物，生活在多變的環(huán)境中，體溫隨環(huán)境溫度改變，有些與溫度有關(guān)的毒性預(yù)測性較差。外部或暴露劑量及暴露時間直接從測定結(jié)果獲得。(5) 毒性作用機理和結(jié)構(gòu)活性關(guān)系：偏重于基礎(chǔ)研究，重點在于測定效應(yīng)和臨界(閾值)濃度。(6) 常用檢測方法：通常較新，有些已標(biāo)準(zhǔn)化，但對于生態(tài)系統(tǒng)層次的有效性尚未確定。在介紹、

13、討論和評價各種方法的理論和實踐意義時，經(jīng)常涉及生物指示物、標(biāo)記物，生態(tài)指示物和模型。生物指示物的一般概念和原理生物指示物可被視為了解一種條件和狀態(tài)的手段。利用生物指示物所依托的一般原理在于有機體對生態(tài)環(huán)境特定條件或特定條件變化的產(chǎn)生響應(yīng)，而且生物響應(yīng)可加以測定。生態(tài)指示物是指示生態(tài)系統(tǒng)條件/狀態(tài)的生物響應(yīng)，但不一定是生態(tài)系統(tǒng)水平上的一種測度。例如湖水中葉綠素a濃度是仲夏浮游植物群落的一種生物測度，并用于有關(guān)磷濃度的湖泊生態(tài)系統(tǒng)整體狀態(tài)的指示物。高濃度磷會導(dǎo)致富營養(yǎng)化，引起湖泊中多種營養(yǎng)水平的響應(yīng)。評價富營養(yǎng)化程度，盡管可選用磷濃度或一些魚的種群和群落參數(shù)，但對于常規(guī)評價，葉綠素a測定是可靠且相

14、對簡單的指示物。理想的生物指示物條件：生物響應(yīng)可以定量化；專用于擾動；在實驗室和現(xiàn)實環(huán)境中均可進行觀察；對系統(tǒng)整體功能有重復(fù)性和可靠性。區(qū)分兩種生物響應(yīng)：(1) 達到某一實驗終點；(2) 某一化學(xué)物質(zhì)在組織中積累。生物指示物和生物監(jiān)視器的定義：推薦將生物指示物用于所有類型的響應(yīng)，從亞細胞至系統(tǒng)，而不是物質(zhì)累積。而生物監(jiān)視器則主要針對機體累積類型。兩者的性質(zhì)比較(參見下述表格)生物指示物和生物監(jiān)視器性質(zhì)比較對潛在有毒物的耐受性和抵抗性(I) 耐受性：指一種經(jīng)受暴露于非正常高濃度物質(zhì)(元素或化合物)的能力，這些物質(zhì)能導(dǎo)致負面生物效應(yīng)且能不確定地加以維持。最常提及的例子出現(xiàn)在物種的內(nèi)部，給定物種的生

15、態(tài)類型或種系表現(xiàn)出一種經(jīng)受給定污染物濃度的能力，該濃度對原始種系明確有害。(II) 耐受機理a. 阻止有毒物的吸收；b. 吸收然后將污染物存放于與機體相隔離的結(jié)構(gòu)中(如結(jié)石，特殊的包裹物和液泡)或者以非生物活性形式存放；c. 內(nèi)部或外部降解化學(xué)物成為較少危害的物質(zhì)；d. 吸收然后通過細胞的排泄而排除；e. 回避(僅對可運動的生物)。生物尺度問題(1) 生化標(biāo)記物/指示物的原理和性質(zhì)生化指示物的特征：(i) 在較大的有機體范圍內(nèi)能觀察到特定的生化響應(yīng)；(ii)響應(yīng)專用于特定污染物或污染物族；(iii)實驗室結(jié)果應(yīng)與野外響應(yīng)有關(guān)；(iv)生化響應(yīng)與功能降低或削弱相關(guān)或有關(guān)聯(lián)。對于第(iv)點存在爭

16、議：觀察到的生化和生理參數(shù)體現(xiàn)病理學(xué)條件的程度，病理學(xué)條件調(diào)和有機體整體適應(yīng)性?，F(xiàn)有幾種方法以澄清這種理解上的爭議：(a)野外采集物種的生化標(biāo)記物已經(jīng)與暴露于實驗室條件下特定化學(xué)物或化學(xué)物組；(b)沿污染梯度的不同樣點測定采集的生化標(biāo)記物；(c) 證據(jù)權(quán)重策略得到不同生化標(biāo)記物相關(guān)性的支持。(2) 常用的生化標(biāo)記物組酶；單(加)氧酶(混合功能氧化物酶)；階段II結(jié)合酶(glutathione谷胱甘肽轉(zhuǎn)運酶)；DNA損傷和修復(fù)生物標(biāo)記物；金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽；受迫蛋白；免疫功能；組織病理學(xué)；生長域范圍(scope)。常用生化標(biāo)記物的樣例刺激物響應(yīng)專一性有機體健康關(guān)聯(lián)光化學(xué)氧化物，酸性沉降，過

17、氧化物生成抗氧化酶或非酶的抗氧化物無通過膜受體混亂生成自由基，混和功能氧化物活性受酶和非酶控制。過度自由基產(chǎn)生損害DNA，膜脂，和蛋白；壓制自由基產(chǎn)生會抑制免疫響應(yīng)氯化烴和芳香烴(PAHs)產(chǎn)生細胞色素P450，單(加)氧酶有氧化有機物，并轉(zhuǎn)為更多的極化(易溶)形式。引發(fā)致癌中間體痕量金屬，有機化學(xué)物階段II結(jié)合酶無增加異體化合物的溶解度和去除速率鉛氨基果糖酸脫水酶有改變氨基果糖酸脫水酶活性，干擾鐵/細胞色素代謝有機磷酸鹽，氨基甲酸鹽，合成除蟲菊酯殺蟲劑通過攻擊酶上羥基抑制乙酰膽堿酯酶活性有神經(jīng)傳導(dǎo)元過度興奮，神經(jīng)肌肉功能損失刺激物響應(yīng)專一性有機體健康關(guān)聯(lián)某些B族和邊界金屬(Ag, Cd, C

18、u, Hg, Zn)金屬硫因合成有限控制組織中金屬分布(去毒功能)，清除自由基物理和化學(xué)擾動(如鹽度、滲透壓變化、冷熱沖擊等)合成受迫蛋白，或稱熱沖擊蛋白無涉及細胞修復(fù)金屬，有機物改變免疫功能。巨噬細胞活性無因暴露于先前的刺激， 巨噬細胞活性受損PAHs, PCBs組織病理學(xué)。上皮組織腫瘤，腎臟損害無組織損害來自與污染物直接接觸乙炔基雌二醇, 烷基酚, 有機氯殺蟲劑, PCBs, 鄰苯二甲酸酯/鹽破壞生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)無老鼠雌性生殖區(qū)增殖。非天然生成卵黃蛋白原常用生化標(biāo)記物的樣例(續(xù))(3) 獨立物種作為指示物(參見表格)或監(jiān)視器(參見表格)；(4) 生態(tài)系統(tǒng)指示物的替代物至少須滿足三個基準(zhǔn)條件用

19、以限定物種作為替代物種：a. 必須是其所參與食物網(wǎng)的強大的累積者； b. 必須是所在系統(tǒng)中數(shù)量豐富且分布廣泛；c. 必須是易于識別且生態(tài)相關(guān)?？芍甘经h(huán)境壓迫的群落水平響應(yīng)：a. 生物體平均大小降低；b. 生物量降低(biomass)；c. 特有種被普通種代替；d. 物種豐度降低(物種數(shù)目)；e. 群落組成改變(相對豐度)；f. 某些物種生殖損害；g. 食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和長度改變；h. 捕食者數(shù)目減少，被捕食者數(shù)目增加。陸生指示物種的樣例陸生指示物物種混亂響應(yīng)應(yīng)用陸生香草基質(zhì)中放射活性基因突變導(dǎo)致花朵顏色改變放射性礦物調(diào)查診斷地衣、苔蘚附生植物的群落SO2群落變化：物種出現(xiàn)或消失基于地衣群落指數(shù)規(guī)劃S

20、O2污染帶比例地衣、苔蘚附生植物的群落，設(shè)計14種，移植在樹皮片上SO2內(nèi)外扁平體狀態(tài)變化地衣扁平體傷害程度與SO2平均濃度相關(guān)性地衣、苔蘚附生植物的群落，12種SO2分布模式，靠近源，物種數(shù)少，隨距離增加提供快速的評價方法和確定長距離點源污染地衣、苔蘚花對SO2耐受程度不同的物種SO2樹上附生物種的組成污染敏感物種的重新出現(xiàn)提示空氣質(zhì)量改善人工基質(zhì)上的地衣、苔蘚SO2伴隨大氣污染削減，物種重新入侵響應(yīng)慢，除SO2外，可能存在其它影響參數(shù)捕食鳥類有機氯污染(PCB, DDE)蛋殼變薄，卵營養(yǎng)不良食物鏈效應(yīng)評價；污染源遷移恢復(fù)評價水生指示物種的樣例指示物物種混亂響應(yīng)應(yīng)用蜉蝣類幼體湖泊酸化低pH條

21、件下物種消失低堿度湖：酸化早期預(yù)警硅藻多物種種群湖泊酸化物種組成和豐度削弱親酸或親堿條件，為重建湖泊化學(xué)歷史或現(xiàn)狀，改變條件以計算硅藻推斷pH硅藻物種范圍來自大量湖泊沉積物的數(shù)據(jù)庫基于酸中和容量的酸靈敏度，與硫沉積有關(guān)物種組成和豐度以設(shè)置臨界SO2負荷的效應(yīng)劑量關(guān)系建立硅藻古湖沼模型蜉蝣類幼體湖泊營養(yǎng)化狀態(tài)中營養(yǎng)條件下優(yōu)勢種湖水、沉積物質(zhì)量評價顫蚓寡毛環(huán)節(jié)動物營養(yǎng)增強中營養(yǎng)條件下優(yōu)勢種湖水、沉積物質(zhì)量評價白星眼魚湖泊營養(yǎng)化狀態(tài)中營養(yǎng)條件下優(yōu)勢種湖水、沉積物質(zhì)量評價片腳類動物湖泊營養(yǎng)化狀態(tài)貧營養(yǎng)條件下優(yōu)勢種湖水、沉積物質(zhì)量評價湖鮭魚湖泊營養(yǎng)化狀態(tài)貧營養(yǎng)條件下優(yōu)勢魚種湖水、沉積物質(zhì)量評價蚤湖泊營養(yǎng)

22、化狀態(tài)富營養(yǎng)條件下優(yōu)勢種用于環(huán)境監(jiān)測的陸生物種樣例監(jiān)視器物種混亂參數(shù)測定應(yīng)用苔蘚羽狀苔蘚大氣污染苔蘚組織中金屬濃度評價北極大氣污染來源苔蘚羽狀苔蘚無機污染，大氣沉降，當(dāng)?shù)鼗騻鬏斀饘?、類金屬元素時空監(jiān)測氣生污染物，長距離傳送通常與濕性沉降有關(guān)苔蘚羽狀苔蘚PCBs大氣沉降PCBs同系物濃度范圍在監(jiān)測時段內(nèi)，指示PCB總濃度降低苔蘚羽狀苔蘚、沼澤苔蘚、附生植物苔蘚天然生長苔蘚評價作為金屬沉降監(jiān)視關(guān)注極地地區(qū)苔蘚中金屬含量利用苔蘚作為重金屬大氣沉降監(jiān)測器，注意苔蘚數(shù)據(jù)經(jīng)沉降數(shù)據(jù)校正，評價非大氣污染源的貢獻地衣苔蘚大氣沉降中的污染地衣吸收大氣沉降的過程：顆粒捕獲、離子交換、被動和主動吸收不同尺度監(jiān)測大氣

23、沉降。考慮種間差異地衣苔蘚硫和鉛在加拿大東部沉積測定不同地域地衣中的濃度顯著的差異表明散發(fā)和沉降速率差異鯡鷗鷗卵 跟蹤污染時序，濃度降低檢驗恢復(fù)卵中污染物濃度環(huán)境中各種來源的異體有機污染物，可能進入人類食物鏈，有機氯農(nóng)藥和PCB點源污染的時間記錄，或氣生污染長距離遷移，重現(xiàn)污染的歷史場景測定各年輪中金屬含量，代表當(dāng)時暴露于金屬的環(huán)境大氣金屬沉降，土壤痕量元素污染楓糖樹輪年生長鈾的濃度遠低于10年前。除礦區(qū)附近，非礦渣附近地衣扁平體中鈾和釷濃度也較高包括鈾在內(nèi)的多種金屬濃度靠近鈾礦的痕量金屬模式地衣利用鉛同位素比率進行來源鑒定地衣、高等植被、湖泊沉積物中鉛同位素組成(206Pb, 207Pb, 208Pb)北方森林鉛污染附生植物苔蘚地衣應(yīng)用參數(shù)測定混亂物種監(jiān)視器用于環(huán)境監(jiān)測的陸生物種樣例(續(xù))用于環(huán)境監(jiān)測的水生物種樣例營養(yǎng)化水體中成功的金屬監(jiān)視器