病原學(xué)、免疫學(xué)及生化檢測詳解課件

1、病原學(xué)、免疫學(xué)及生化檢測微生物是存在于自然界中的一群體形細(xì)小、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼直接看不見、必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大幾百倍、幾千倍甚至幾萬倍才能觀察到的微小生物。使用油鏡時，需在玻片上滴加香柏油。這是因為油鏡的放大倍數(shù)較高，而透鏡很小，光線通過不同密度的介質(zhì)物體（玻片空氣透鏡）時，部分光線會發(fā)生折射而散失，進入鏡筒的光線少，視野較暗，物體觀察不清。如在透鏡與玻片之間滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），則使進入油鏡的光線增多，視野亮度增強，物象清晰。 一、微生物分類微生物雖然個體微小，但具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，所以按其結(jié)構(gòu)和組成的差異分為三大類1、非細(xì)胞型

2、微生物：體積微小，能通過濾菌器，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，如病毒、噬菌體；2、原核細(xì)胞型微生物：僅有原始核，無核仁和核膜，缺乏完整的細(xì)胞器，如細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體；3、真核細(xì)胞型微生物：細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體，胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器，如霉菌、酵母菌、藻類等。二、細(xì)菌生長繁殖的條件1、充足的營養(yǎng)。水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子。2、合適的酸堿度。大多數(shù)為中性或弱堿性，即PH7.2-7.6。個別細(xì)菌在較堿性的培養(yǎng)基中生長良好。3、適宜的溫度。分為嗜冷菌、嗜熱菌、嗜溫菌。4、必要的氣體環(huán)境。主要是氧與二氧化碳。三、細(xì)菌群體的生長繁殖分期1、遲緩期。此期中細(xì)菌體積增大，代謝活

3、躍但不分裂，菌數(shù)并不增多。此期長短不一，從數(shù)小時到數(shù)天不等，視菌種、菌齡與接種菌量和營養(yǎng)物質(zhì)的不同而異。2、對數(shù)生長或指數(shù)期。此期中細(xì)菌生長迅速，以恒定的速度進行分裂繁殖，菌數(shù)以幾何級數(shù)增長，增長極快。研究細(xì)菌的性狀最好選用此期的細(xì)菌。3、穩(wěn)定期。對數(shù)期后，細(xì)菌繁殖速度逐漸下降，細(xì)菌繁殖數(shù)與死亡數(shù)幾近相等，活菌數(shù)保持穩(wěn)定。4、衰亡期?；罹鷶?shù)急劇減少。四、細(xì)菌的染色1、分為單染法、復(fù)染法、特殊染色法、負(fù)染色法、熒光染色體法等。單染法：只用一種染液，可顯示細(xì)菌的形態(tài)與排列，不能顯示細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與染色反應(yīng)的特性。原理：由于細(xì)菌在中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料如美藍、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、孔雀

4、綠、番紅等進行染色。這類染料解離后，染料離子帶正電荷，使細(xì)菌著色。復(fù)染法：用兩種以上不同顏色的染料進行染色，除可觀察細(xì)菌的形態(tài)、排列、大小外，還能將細(xì)菌染成不同的顏色。常用的革蘭氏染色法和抗酸染色法即為復(fù)染法。2、革蘭氏染色法2.1原理：依據(jù)的是細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分和結(jié)構(gòu)的不同，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚，交聯(lián)而成的肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，經(jīng)乙醇處理發(fā)生脫水作用，使孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫與碘形成大分子復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色，結(jié)果使細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性菌肽聚糖層薄，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)少，而且類脂含量較高，經(jīng)乙醇處理后，類脂被溶解，細(xì)胞壁孔徑變大，通透性增加，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)

5、胞壁，因而細(xì)胞被染色，再經(jīng)番紅復(fù)染后細(xì)胞呈紅色。2.2試劑：2.2.1堿性染料 草酸銨結(jié)晶紫液；2.2.2媒染劑 碘液，其作用是增強染料與菌體的親和力，加強染料與細(xì)胞的結(jié)合；2.2.3脫色劑 乙醇，將染料溶解，使被染色的細(xì)胞脫色。利用不同細(xì)菌對染料脫色的難易程度不同，而加以區(qū)分；2.2.4復(fù)染液 番紅溶液，目的是使經(jīng)脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色菌進行比較。2.3操作過程標(biāo)本經(jīng)固定后，先用結(jié)晶紫染色、再加碘液媒染、然后用乙醇脫色，最后用沙黃或復(fù)紅復(fù)染。2.4意義依據(jù)革蘭氏染色可將細(xì)菌分為陽性和陰性兩大類。由于陽性、陰性細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)上的差別可造成對抗生素的敏感性不同，臨床上依據(jù)此，可

6、選擇性針對用藥。1.涂片固定2.單染結(jié)晶紫染液第一次染色 1min 3.媒染碘-碘化鉀溶液浸濕30S4. 脫色95%乙醇溶液進行顏色洗脫5.復(fù)染紅色的藩紅染液第二次染色2.5注意事項2.5.1制片是染色的關(guān)鍵，載片要清潔，不得沾污油脂，菌株才能涂布均勻。注意初次涂片時，取菌量不應(yīng)過大，以免造成菌體重疊。2.5.2注意水流不得直接沖在涂菌處，以免將菌體沖掉。2.5.3脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌，而脫色不夠時陰性菌被誤染為陽性菌。（拉絲試驗未斷裂DNA螺旋）革蘭氏染色1884年丹麥醫(yī)師Gram所發(fā)明紫色者為G菌，紅色者為G菌細(xì)菌呈現(xiàn)第一次染色的

7、效果紫色，革蘭氏陽性菌（紫陽G）；呈現(xiàn)第二次染色的效果紅色；稱革蘭氏陰性菌（紅陰G -）五、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離大多數(shù)細(xì)菌可以用人工方法培養(yǎng)，但必須根據(jù)不同細(xì)菌采取各自適宜的條件，如無菌技術(shù)、接種和分離方法、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等1、樣品處理標(biāo)本采集是否符合要求，直接影響細(xì)菌的檢測結(jié)果，因此要求除糞、痰、咽拭子等標(biāo)本，其他樣本均應(yīng)以無菌技術(shù)采集。標(biāo)本盛于無菌容器內(nèi)，根據(jù)目的菌的種類采用不同的方法采集，標(biāo)本采集后及時冷藏送檢。2、無菌技術(shù)2.1細(xì)菌學(xué)檢驗必須隨時防止污染和病原菌的擴散，為達到此目的而采取的技術(shù)就是無菌技術(shù)或無菌操作，在進行細(xì)菌培養(yǎng)檢查過程中，無論是標(biāo)本采集或培養(yǎng)操作，均需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作

8、技術(shù)。2.2所用器具、培養(yǎng)基等必須嚴(yán)格滅菌，使用過程中不得與未經(jīng)消毒物品接觸，忌長時間暴露于空氣手中，有蓋的應(yīng)迅速蓋上。2.3滅菌的試管、玻璃等在打開蓋后及關(guān)閉前，口部應(yīng)在火焰上通過1-2次，以殺滅可能從空氣中落入的雜菌；接種環(huán)或接種針每次使用前后，均應(yīng)在火焰上燒灼滅菌，金屬棒或玻璃棒部分亦須轉(zhuǎn)動通過火焰3次。2.4進行細(xì)菌檢驗的全過程應(yīng)在無菌室、接種罩或生物安全柜內(nèi)進行。2.5檢驗時忌用手接觸標(biāo)本及已滅菌的器材內(nèi)部，也勿用口吹以防其他雜菌混入培養(yǎng)物中。2.6打開瓶塞及試管塞時，應(yīng)將塞子上端夾持于手指間適當(dāng)位置，不得將棉塞任意放置別處。3、接種、分離及結(jié)果觀察接種細(xì)菌應(yīng)用接種環(huán)（針）來蘸取細(xì)菌

9、標(biāo)本，進行接種，其程序可分為：滅菌接種環(huán) 冷卻 蘸取細(xì)菌標(biāo)本 進行接種 接種環(huán)滅菌5個程序。細(xì)菌的接種與分離技術(shù) 平板分區(qū)劃線法 每劃完一區(qū)，要將接種環(huán)滅菌 2 斜面接種法-常用于雙糖管接種 3 液體接種法-糖類微量生化管 4 穿刺法 -常用于半固體接種 5 傾注平板法-自來水細(xì)菌計數(shù) 6 涂布接種法-紙片法藥敏試驗六、生化反應(yīng)1、各種細(xì)菌具有各自獨特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所產(chǎn)生的分解和合成的代謝產(chǎn)物也不同，這些分解或合成代謝產(chǎn)物又各有不同的生化特點，利用此生化特點來檢查代謝產(chǎn)物以鑒別細(xì)菌的方法，稱為生化反應(yīng)。2、生化反應(yīng)主要分為糖類的代謝試驗、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗、有機酸鹽和銨鹽的利

10、用試驗、呼吸酶類試驗及其他酶類試驗。2.1碳水化合物的代謝試驗 糖、醇、苷發(fā)酵試驗 糖細(xì)菌生長分解糖產(chǎn)酸PH不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗。淀粉水解試驗 某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。 O/F（葡萄糖）試驗 細(xì)菌分解葡萄糖時利用分子氧氧化型(O)無氧降解發(fā)酵型(F)不分解葡萄糖產(chǎn)堿型(-)一管加石臘油 FO堿ONPG試驗 鄰-硝基酚-半乳糖（黃色 ）-半乳糖苷酶 細(xì)菌鄰-硝基-半乳糖 陽性-黃色陰性對照-無色本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；

11、產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。1.下黃上不黃 為分解葡萄糖，不分解乳糖2.上下均黃 為分解葡萄糖、乳糖3.上下均不黃 為非發(fā)酵菌4.中間變?yōu)楹谏珵楫a(chǎn)H2S沙門氏菌的TSI試驗VP、MR試驗 葡萄糖丙酮酸乙酰甲醇二乙酰胍基紅色 VP陽性 肺炎克雷伯菌甲酸、乙酸PH甲基紅試劑紅色 MR陽性 大腸埃希菌VPMR陽陰陽對V-P試驗?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在

12、強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。甲基紅（Methyl Red）試驗?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。2.2蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗 吲哚試驗 細(xì)菌 （色氨酸酶）蛋白胨水吲哚柯氏試劑紅色靛基質(zhì)（Imdole）試驗?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 尿素試驗 細(xì)菌NH3、PH紅色 尿

13、素陽性尿素尿素酶（Urease）試驗有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。1、未接種2、尿素酶陽性3、尿素酶陰性苯丙氨酸脫氨酶試驗 苯丙氨酸細(xì)菌苯丙酮酸FeCI3綠色 氨基酸脫羧酶試驗 石蠟油葡萄糖溴甲酚紫精aa葡萄糖溴甲酚紫賴aa葡萄糖溴甲酚紫烏aa葡萄糖溴甲酚紫對照管2.3碳源和氮源利用試驗 枸櫞酸鹽試驗 細(xì)菌檸檬酸三鈉Na2CO3PH深藍色 枸椽酸鹽試驗?zāi)承┘?xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。硝酸鹽還原試驗 細(xì)菌NO3- NO2 NO2對氨基苯磺酸（甲液

14、）對重氮基苯磺酸 對重氮基苯磺酸-萘胺（乙液）紅色（） NO3細(xì)菌甲、乙液無色（-）鋅粉（還原劑）紅色為陰性 無色為陽性 NO3細(xì)菌NO2N2NH32.4酶類試驗細(xì)菌血漿 結(jié)合凝固酶 纖維蛋白肉眼可見凝集細(xì)菌血漿 游離凝固酶纖維蛋白血漿凝固 CAMP試驗 B群鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，促進金葡溶血更好 凝固酶試驗七、血清學(xué)試驗1、基本概念1.1血清學(xué)試驗是利用抗原抗體在適宜條件下的體外特異反應(yīng)，可作為抗原抗體的檢測。1.2抗原：是一種刺激機體引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋巴細(xì)胞，并能在體外與其相應(yīng)的抗體（或）致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。具有免疫原性和反映原性。1.3抗體：是機體在

15、抗原物質(zhì)刺激下所形成的一類具有與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的有特定結(jié)構(gòu)的球蛋白。2、基本特性高度特異性:此類反應(yīng)是由于抗原決定族與抗體結(jié)合部位之間的物理化學(xué)特性相對應(yīng)而相互結(jié)合的，故有特異性。高度敏感性：檢測限可達到納克級甚至皮克級，其中以放免測定的敏感性最高，較差的是凝集反應(yīng)和各種沉淀反應(yīng)。合適比例：當(dāng)抗原抗體的量比例合適時出現(xiàn)明顯的反應(yīng)，且反應(yīng)速度快，不合適的比例即不出現(xiàn)反應(yīng)，屬于抑制帶?？赡嫘裕嚎乖c抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，是非共價鍵的結(jié)合，這樣結(jié)合雖相當(dāng)牢固，但在一定條件下兩者可以解離，如在復(fù)合物中加入酸、堿、過高的溫度等。反應(yīng)過程的二階段性：第一階段為抗原抗體的特異性結(jié)合，需時很

16、短，但無可見現(xiàn)象。第二階段形成可見反應(yīng)，需時較長，從數(shù)分鐘到數(shù)小時不等。3、影響因素溫度：合適的溫度可加快反應(yīng)，特別是第二階段受溫度影響較大，一般以15-40攝氏度為宜，37攝氏度最適宜。電解質(zhì)：抗原抗體結(jié)合可不需要電解質(zhì)，但復(fù)合物的相互凝集出現(xiàn)可見反應(yīng)則需要電解質(zhì)的存在。PH：可影響反應(yīng)的電離和點和性質(zhì)，血清反應(yīng)最適宜為6-8.振搖和攪拌：可加速反應(yīng)物的相互碰撞和接觸，從而增快形成可見反應(yīng)的速度。4、反應(yīng)基本類型4.1凝結(jié)反應(yīng)4.1.1細(xì)菌等顆粒性抗原加入相應(yīng)抗體在適量電解質(zhì)存在下，發(fā)生特異性反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集小塊?？煞譃橹苯雍烷g接兩大類。4.1.2直接凝集反應(yīng)：指顆?？乖苯优c相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊，具體有玻片法和試管法。玻片凝集反應(yīng)為定性反應(yīng)，常用于細(xì)菌的鑒定與分型。4.1.3間接凝集反應(yīng)：是將可溶性抗原或抗體吸附于一種與免疫無關(guān)的一定大小的微粒上，使成致敏微球，然后與相應(yīng)的抗體或抗原作用所發(fā)生的凝集。微球應(yīng)用最多的是人O型紅細(xì)胞及羊紅細(xì)胞。4.2沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的條件下，形成可見的沉淀物。其反應(yīng)機制與凝集反應(yīng)基本相同，不同點是凝集反應(yīng)的抗原是比較大的顆粒性物質(zhì)、