植物種質(zhì)資源離體超低溫保存課件

1、植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述植物種質(zhì)資源保存主要有原地保存、異地保存和設(shè)施保存3種方式.設(shè)施保存是當(dāng)前最有效、最安全的保存方式,它包括種子低溫保存、超低溫保存及種質(zhì)離體保存等方法. 植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述原地保存是指在植物資源豐富的地區(qū)建立自然保護(hù)區(qū)、原地保存林等，以保護(hù)植物種質(zhì)資源及其生境；異地保存是指當(dāng)天然群體的遺傳組成發(fā)生嚴(yán)重的變化，或存在潛在破壞威脅的物種，在植物種的非本地群體中收集種子或繁殖材料，營(yíng)建異地保存林(圃)進(jìn)行集中保存。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述設(shè)施保存，也叫設(shè)備保存、離體保存，就是利用種質(zhì)資源庫(kù)(冷藏庫(kù)、超低溫庫(kù)、組織培養(yǎng)室)等

2、保存設(shè)施長(zhǎng)期保存種子、配子體、器官、組織、細(xì)胞等種質(zhì)材料，來(lái)達(dá)到保存植物種質(zhì)資源的目的，它也可以被看作是異地保存中的一種形式。設(shè)施保存可以大批量貯藏種質(zhì)材料于一個(gè)較小的可以人工控制的空間，并能安全地保存種質(zhì)30-50年以上，具有種質(zhì)不易丟失、便于交換和利用等特點(diǎn)，是一種行之有效的保存方式。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述世 界 自 然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)在1978年出版的植物紅皮書(shū)一書(shū)中指出:在全世界分布的約25萬(wàn)種維管束植物中，估計(jì)約有2萬(wàn)一萬(wàn)種(占整個(gè)區(qū)系成分的10%)處于很稀少或受嚴(yán)重威脅的狀況，這意味著人類賴以生存的植物資源陷人了生存危機(jī)。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概

3、述我國(guó)是一個(gè)植物資源豐富的國(guó)家，約有高等植物3萬(wàn)多種，占世界第三位，位居北半球之首，并且特有程度高，生物區(qū)系起源古老，是世界上屈指可數(shù)的植物遺傳資源起源中心之一，但其物種流失的態(tài)勢(shì)也不容樂(lè)觀。據(jù)估計(jì)，我國(guó)有高等植物萬(wàn)種，受到滅絕威脅的約有4 000-5000種，占總數(shù)的12%一15%左右。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 早在上個(gè)世紀(jì)中葉，世界各國(guó)就已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行植物(包括作物和森林植物)種質(zhì)資源的收集和保存工作。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在1947-1948年成立了“動(dòng)植物遺傳資源委員會(huì)”，1967年成立了森林遺傳資源專家組。FAO/IBPGR支持和協(xié)調(diào)國(guó)家與地區(qū)的遺傳資源的調(diào)查、保存和

4、利用，負(fù)責(zé)咨詢有關(guān)提案和計(jì)劃，并在利用有限資金保存作物種質(zhì)資源。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 目前，發(fā) 達(dá)國(guó)家的種質(zhì)資源研究已進(jìn)人到常規(guī)方法與分子技術(shù)相結(jié)合的研究階段，分子標(biāo)記技術(shù)的利用大大加快了種質(zhì)資源鑒定的速度和準(zhǔn)確性。美國(guó)田間種植圃保存的10萬(wàn)份無(wú)性繁殖生物種質(zhì)資源，已有56%進(jìn)行了同功酶,RAPD,AFLP和SSR等分子標(biāo)記的種質(zhì)學(xué)評(píng)價(jià)，33%的資源圃建立了核心種質(zhì)資源。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 保存種 子 、配子、器官或組織等，在人工條件下使植物的基因(載體)能得到延續(xù)，為未來(lái)的植物利用、培育計(jì)劃服務(wù)，這是當(dāng)前世界各國(guó)生物多樣性保護(hù)工作的重點(diǎn)之一。植物種質(zhì)

5、資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 全世界到1996年已建成1300多座植物種質(zhì)資源保存庫(kù)，共保存各類植物種質(zhì)610萬(wàn)份(含重復(fù))，其中低溫庫(kù)保存550萬(wàn)份，田間種植保存庫(kù)52. 7萬(wàn)份，試管苗保存萬(wàn)份。1958年建成的美國(guó)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)是世界上第一座現(xiàn)代化種質(zhì)庫(kù)，該庫(kù)于1992年擴(kuò)建成庫(kù)容100萬(wàn)份的現(xiàn)代化國(guó)家種質(zhì)庫(kù)，已保存各類植物種質(zhì)資源55萬(wàn)份，在科羅拉多Fort Collins的種子庫(kù)則在一196保存了26萬(wàn)份含水量6%的植物種子。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 發(fā)展中國(guó)家印度也于1976年成立國(guó)家植物種質(zhì)資源局(NBPGR)，下設(shè)30個(gè)單位組成全印植物種質(zhì)資源保存體系，已保存20

6、萬(wàn)份種質(zhì)，每年用于植物種質(zhì)資源保存維護(hù)費(fèi)110萬(wàn)美元；1997年建成庫(kù)容100萬(wàn)份的國(guó)家植物種質(zhì)資源庫(kù)，成為世界植物種質(zhì)資源大國(guó)。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 英國(guó) 皇 家 植物園邱園的千年種子庫(kù)工程(ms-BP)，是目前世界上最大的種質(zhì)設(shè)施保存庫(kù)。該庫(kù)于2001年建成并投人使用，MSBP計(jì)劃到2010年使得全世界干早地區(qū)2. 4萬(wàn)種以上(約10%)的植物種子得到收集和保存，目前已收集保存了全英國(guó)95%的植物種質(zhì)資源，并與澳大利亞、埃及、肯尼亞、南非等12個(gè)國(guó)家開(kāi)展了合作，收集以干早地區(qū)為主的植物種質(zhì)資源，計(jì)劃到2025年完成收集保存全球萬(wàn)種植物(約占1000)種質(zhì)資源的目標(biāo)。植物

7、種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 我國(guó)是植物種質(zhì)資源豐富的國(guó)家，植物種質(zhì)設(shè)施保存工作近幾年也有較大的發(fā)展，我國(guó)也已有一些科研單位建立了一批大、中、小型種質(zhì)基因庫(kù)。特別是在農(nóng)作物品種資源保存方面已初步形成體系，中國(guó)農(nóng)科院在1984年和1986年分兩期在北京建立了一座較大型的國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)庫(kù)，包括一座長(zhǎng)期庫(kù)和一座中期庫(kù)，而于90年代初又在青海建立了一個(gè)“復(fù)份庫(kù)”，至2000年，已保存了33萬(wàn)份材料。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 但是，我國(guó)的林木及野生植物種質(zhì)資源設(shè)施保存仍處于起步階段，中科院于1996年在西雙版納熱帶植物園建立了一個(gè)小型的熱帶瀕危植物種質(zhì)庫(kù)，其實(shí)施保存的種質(zhì)范圍僅限

8、于熱帶地區(qū)的瀕危植物;中國(guó)林科院于2001年建成了一座小型低溫庫(kù)，目前保存了我國(guó)部分主要造林樹(shù)種的種質(zhì)資源，尚未完成搶救保存任務(wù)，離全面保存我國(guó)森林植物的種質(zhì)資源目標(biāo)相去甚遠(yuǎn)。目前，中國(guó)林科院牽頭的國(guó)家森林植物種質(zhì)低溫庫(kù)正處于籌建當(dāng)中，該庫(kù)能夠容納30萬(wàn)份以上的林木種質(zhì)，該庫(kù)的建成將完成搶救保存林木種質(zhì)資源的任務(wù)。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述 一、植物種質(zhì)資源低溫保存意義防止資源滅絕節(jié)約人力物力便于交流植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述二、超低溫保存的概念一般來(lái)說(shuō)，低溫所涉及的溫度范圍是不確定的。習(xí)慣上，人們將80以下的低溫稱為超低溫，干冰溫度（70）稱為極低溫，低溫則從4往

9、下推（李廣武等，1998）。對(duì)植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。如果低溫超過(guò)細(xì)胞原生質(zhì)所能忍受的臨界溫度，就會(huì)致使植物細(xì)胞遭受凍害而死亡。如甜橙樹(shù)發(fā)生凍害的臨界溫度通常在6.5，枳殼通常在20左右（沈德緒等，1986）。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述目前常用的超低溫保存方法可分為兩類，即冷凍誘導(dǎo)保護(hù)性脫水的超低溫保存和玻璃化處理的超低溫保存。在超低溫條件下，生物的代謝和衰老過(guò)程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長(zhǎng)期保存植物材料。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述三、超低溫保存的研究概況1超低溫保存技術(shù)的發(fā)展種質(zhì)材料的超低溫保存，傳統(tǒng)的技術(shù)有干凍法、預(yù)凍法和兩步法，上

10、世紀(jì)80年代末和90個(gè)代初玻璃化法和包埋脫水法開(kāi)始應(yīng)用于植物材料的超低溫保存。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述2用于離體超低溫保存的植物材料超低溫保存技術(shù)在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、胚狀體、原生質(zhì)體、愈傷組織和懸浮細(xì)胞等方面有應(yīng)用和報(bào)道。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第一節(jié) 概 述3超低溫保存的植物種類目前主要應(yīng)用在作物、果樹(shù)和園林花卉種質(zhì)資源保存方面，林木種質(zhì)資源的超低溫保存也有少量報(bào)道。超低溫保存已涉及到不同的植物種類，如野生及人工創(chuàng)造的谷類、豆類、薯類、油類、糖類、纖維類、蔬菜類、果樹(shù)、樹(shù)木、藥用植物和藻類等。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第二節(jié) 植物材料超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)

11、一、細(xì)胞內(nèi)外水的凍結(jié)狀態(tài)是細(xì)胞凍存技術(shù)的關(guān)鍵植物細(xì)胞中含有大量的水分，約占細(xì)胞總重量的6090。細(xì)胞中的水是由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90，很容易凍結(jié)。由于細(xì)胞內(nèi)含有復(fù)雜的化合物，細(xì)胞內(nèi)的溶液并不象純水那樣在0左右結(jié)冰。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第二節(jié) 植物材料超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)理論上講，細(xì)胞外水的凍結(jié)溫度為515 ，細(xì)胞內(nèi)游離水的凍結(jié)在25。30 時(shí)，細(xì)胞幾乎沒(méi)有非凍結(jié)狀態(tài)的游離水存在，而結(jié)合水在100溫度下也不凍結(jié)。根據(jù)Luyet的凍結(jié)理論（Luyet 1937），細(xì)胞游離水的凍結(jié)溫度（30）可被認(rèn)為是細(xì)胞凍存的安全溫度，因而細(xì)胞凍存的兩步凍結(jié)法是以30為基礎(chǔ)的。控制細(xì)胞內(nèi)外

12、水的凍結(jié)狀態(tài)是細(xì)胞凍存技術(shù)的關(guān)鍵。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第二節(jié) 植物材料超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)二、植物細(xì)胞超低溫保存過(guò)程中的致死損傷細(xì)胞超低溫保存有三個(gè)重要操作步驟：一是細(xì)胞預(yù)凍；二是細(xì)胞在196下長(zhǎng)期貯存；三是細(xì)胞解凍。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第二節(jié) 植物材料超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)植物超低溫保存技術(shù)建立在生物細(xì)胞凍害和抗凍機(jī)理的基礎(chǔ)之上。種質(zhì)超低溫保存成功的關(guān)鍵，在于降溫冰凍過(guò)程中避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。為此，針對(duì)不同種類的植物材料，篩選適合的冰凍保護(hù)劑，采用適當(dāng)?shù)慕禍乇鶅鏊俣群突瘍龇绞?，可能使?xì)胞不受損傷或使損傷減小到最低程度。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法 超低溫保存植

13、物種質(zhì)資源的程序包括下面幾個(gè)步聚：(1 )前培養(yǎng):對(duì)培養(yǎng)體短期的生長(zhǎng)鍛煉處理，使其提高耐液氮保存的能力。(2)防凍:培養(yǎng)體放人防凍液中，使其細(xì)胞降低冰點(diǎn)，減少因形成冰晶可能造成的損傷。(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍，降溫速度依不同種質(zhì)材料采用特定的速度。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環(huán)境中，以防止冰的游移或解體。(5)解凍:一般認(rèn)為快速解凍更好。從液氮環(huán)境中取出封裝好的材料，與其容器一同放人+40的無(wú)菌水浴中，直到解凍后才回到室溫下，未封裝的材料放到20-30的液體培養(yǎng)基中解凍。(6)生命力測(cè)定:如用TTC染色法等。植物種

14、質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法1快速冰凍法2慢速冰凍法3兩步法4逐級(jí)冰凍法植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w（玻璃態(tài)）的固化過(guò)程。使溶液玻璃化有兩條途徑：一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法1玻璃化法是將生物材料經(jīng)極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，進(jìn)入玻璃態(tài)。此間水分子沒(méi)有發(fā)生重排，不形成冰晶，也不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和體積的改變，因而不會(huì)對(duì)材料造成傷害。保存終止后，復(fù)溫時(shí)要

15、快速化凍，防止去玻璃化的發(fā)生。材料能安全度過(guò)冷卻和化凍兩個(gè)關(guān)口，就可保證凍存的成功。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法2包埋玻璃化法是包埋脫水法和玻璃化法的結(jié)合。保存材料先用藻酸鈣包埋，然后經(jīng)蔗糖濃度梯度脫水和玻璃化溶液處理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋脫水法要高，可能是藻酸鈣包埋后減輕了玻璃化溶液的毒性。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法三、其它超低溫凍存方法1干凍法（desiccation）利用無(wú)菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行脫水處理，然后快速將其投人液氮貯存。2預(yù)培養(yǎng)法（pregrowth）也叫預(yù)凍法:將種質(zhì)材料在添加保護(hù)

16、劑(如蔗糖、二甲亞礬、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10-700C)中冰凍若干小時(shí)后投人液氮貯存。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第三節(jié) 超低溫保存的方法3預(yù)培養(yǎng)-干燥法(pregrowth-desiccation)也叫兩步法，種質(zhì)材料在添加保護(hù)劑后，用程序降溫儀以某個(gè)速率(每分鐘0. 10. 50C)降溫至轉(zhuǎn)移溫度(4070 0C )，然后投人液氮中貯存，兩步法較預(yù)凍法更為嚴(yán)格。4包埋脫水法（encapsulation- dehydration） 莖尖、分生組織和體細(xì)胞胚等種質(zhì)材料用褐藻酸鈣包埋后，第一階段先在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水，第二階段用無(wú)菌空氣流或干燥硅膠脫水，然后投人液氮貯存

17、。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素 一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細(xì)胞的年齡以及生理狀態(tài)。不同基因型的植物離體材料對(duì)超低溫凍存的反應(yīng)各不相同。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素二、預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉預(yù)處理對(duì)于調(diào)整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過(guò)預(yù)處理的植物材料，減少了細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，使細(xì)胞能經(jīng)受低溫脅迫，減少或避免了冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素三、冰凍保護(hù)劑的應(yīng)用一般的生物體在沒(méi)有添加冰凍保護(hù)劑的情況下經(jīng)歷低溫后是很難存活下

18、來(lái)的。所以，生物體的低溫保存離不開(kāi)冰凍保護(hù)劑（cryoprotective agent，CPA）。冰凍保護(hù)劑也稱作抗凍劑，合理地選擇冰凍保護(hù)劑，對(duì)低溫保存至關(guān)重要。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素冰凍保護(hù)劑應(yīng)具有以下特點(diǎn)：易溶于水，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，容易從組織細(xì)胞中清除。冰凍保護(hù)劑的作用主要表現(xiàn)在增加膜透性，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷害，降低冰點(diǎn)，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶生長(zhǎng)。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素滲透型冰凍保護(hù)劑：多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了

19、水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到保護(hù)的目的。常用的滲透型冰凍保護(hù)劑有：甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但滲透型冰凍保護(hù)劑使用濃度、滲入細(xì)胞的能力、對(duì)水分子活性的影響等各不相同，如甘油適宜于慢速冷卻，而DMSO卻易于滲入細(xì)胞，并在常溫下稍有毒性。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素非滲透型冰凍保護(hù)劑：能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，可在特定溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用。非滲透型冰凍保護(hù)劑主要有：聚乙烯吡咯烷酮（polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，dext

20、rane）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、白蛋白（albumin）、羥乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）等。此類冰凍保護(hù)劑對(duì)快速、慢速冷卻均有保護(hù)效果。 植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素四、化凍方法液泡小、含水量少的細(xì)胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。液泡大、含水量高的細(xì)胞則一般需要采用慢速化凍法。生長(zhǎng)季節(jié)中的材料，一般在3740溫水浴中快速化凍比在室溫下慢速化凍要好。木本植物的冬芽，在超低溫保存后，必須在0低溫下進(jìn)行慢速化凍才能達(dá)到良好的效果。玻璃化凍存的材料在保存終止后，要求快速化凍，以防止由于次生結(jié)冰對(duì)組織細(xì)胞造成的傷害。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第四節(jié) 影響超低溫保存效果的主要因素五、再培養(yǎng)經(jīng)凍存的材料會(huì)不可避免地受到不同程度的傷害。為了減少再培養(yǎng)中的光抑制，利于離體材料恢復(fù)生長(zhǎng)，凍存的材料一般在黑暗或弱光下培養(yǎng)12周，再轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)。再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時(shí)需將大量元素或瓊脂含量減半，有時(shí)則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生長(zhǎng)的恢復(fù)。植物種質(zhì)資源離體超低溫保存第五節(jié) 超低溫保存過(guò)程中的遺傳變異及其檢測(cè)技術(shù)無(wú)論哪種種質(zhì)資源的保存方法都是以保持物種原有的遺傳特性為出發(fā)點(diǎn)。在超低溫保存過(guò)程中，植物材料是否