分子遺傳學(xué)課件：17-基因治療

1、第十一章 基因治療（Gene Therapy）第十一章 基因治療 現(xiàn)在已經(jīng)證明小英的疾病是由于HERG基因發(fā)生突變而引起的，普通藥物已經(jīng)很難完全控制其疾病的發(fā)展。那么，有沒有辦法改善其病程？ 基因治療（Gene therapy） ：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。一、基因治療策略1、直接基因治療：糾正突變基因 在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實(shí)現(xiàn)）2、間接療法：以正常的基因替代致病基因。 導(dǎo)入外源正?；?，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。用DNA重組技術(shù)設(shè)

2、法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。 第十一章 基因治療二、基因治療的途徑： 1、生殖細(xì)胞基因治療：將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。 2、體細(xì)胞基因治療：將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。第十一章 基因治療三、基因治療的方法： 1. 目的基因的獲得 人工合成 逆轉(zhuǎn)錄 基因組DNA 第十一章 基因治療 2. 外源基因的轉(zhuǎn)移 物理方法：電穿孔法、顯微注射法、微粒子轟擊法 化 學(xué)法 ：磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體

3、(Liposome) 融合法 病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viral mediated transfer） 感染細(xì)胞重組病毒第十一章 基因治療 逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) 常用的病毒載體 DNA病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus） 病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。 第十一章 基因治療 第十一章 基因治療 例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)： LTR LTR gag pol envU3 R U5 U3 R U5U3=增強(qiáng)子，R=啟動子，U5=

4、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 =病毒包裝信號，gag =核心抗原，pol=逆轉(zhuǎn)錄酶， env=外殼蛋白。 第十一章 基因治療逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100%病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá)宿主范圍廣，可同時(shí)感染大量細(xì)胞并長期存留缺點(diǎn)病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；隨機(jī)插入靶細(xì)胞基因組中，使插入點(diǎn)附近的基因過度表達(dá)或失活，插入的外源基因可能不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。第十一章 基因治療第十一章 基因治療第十一章 基因治療 受體載體轉(zhuǎn)移法：將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識別的特異性多肽（配體）形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。

5、重組質(zhì)粒配體細(xì)胞膜復(fù)合物第十一章 基因治療 同源重組技術(shù)（homologus recombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。第十一章 基因治療NEOMYCINXXNEOMYCIN第十一章 基因治療Positive selection:- neomycin phosphotransferase (neo)- hygromycin phosphotransferase (hyg)- puromycine (pur)- hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt)Negative selection：- thym

6、idine kinase (tk)- cytosine deaminase (cd)- hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hprt)同源重組成果細(xì)胞的篩選：第十一章 基因治療啟動子缺失篩選法Poly-A缺失篩選法正負(fù)篩選策略（positive and negative election，PNS）HR112HR23HR1b-geoHR23HR1b-geoHR23Genomic LocusTargetingVectorMutant LocusHSVtkSTOP CODONS四、靶細(xì)胞的選擇 靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞 選擇靶細(xì)胞的原則是：1）必

7、須較堅(jiān)固，便于體外培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳技術(shù)操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)3）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長（能存活幾月至幾年，或整個(gè)生命周期）4）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。第十一章 基因治療 常見的靶細(xì)胞外周血T淋巴細(xì)胞上皮細(xì)胞內(nèi)皮皮膚成纖維細(xì)胞造血干細(xì)胞地中海貧血、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等肝C家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細(xì)胞第十一章 基因治療 基因治療的原則選擇適當(dāng)?shù)募膊?，清楚疾病的發(fā)病機(jī)理，Gene的結(jié)構(gòu)和功能。被糾正的基因已克隆，并清楚Gene表達(dá)與調(diào)控機(jī)制與條件。選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并在體外有效表達(dá)。安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法，以及供利用的動物模型。第十一章 基因治療 基因治療的應(yīng)用

8、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子） ADA缺乏癥致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。第十一章 基因治療 基因治療的應(yīng)用 乙型血友?。?991年我國基因治療成功的例子，薛京倫） XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3-q27.2。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 + F-cDNA 重組體 5 LTR F neo SV PSO LTR 3患者皮膚成纖維細(xì)胞，治療表達(dá)5%第十一章 基因治療 基因治療的應(yīng)用 黑色素瘤的基因治療 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。 第十一章 基因治療 基因治療的應(yīng)用自殺基因的基因治

9、療 第十一章 基因治療 基因治療的應(yīng)用 反義核酸基因治療 第十一章 基因治療腫瘤特異性基因治療從單靶點(diǎn)打擊到多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)打擊 黃 辰 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基因治療存在的問題與論理學(xué)1.導(dǎo)入基因的持續(xù)性和高效表達(dá)2.Gene治療與社會倫理道德（生殖細(xì)胞基因治療） 第十一章 基因治療腫瘤生長的特點(diǎn) 多基因參與的生長調(diào)節(jié)失控 多基因參與的死亡抵抗 多基因參與的免疫逃逸 多基因參與的免疫抑制 腫瘤治療藥物的缺陷 單通路、單靶點(diǎn)藥物開發(fā) 腫瘤治療的非特異性副作用現(xiàn)有基因治療的手段 癌基因的抑制 抑癌基因的添加 藥物敏感基因的添加 免疫增強(qiáng) 腫瘤疫苗 腫瘤基因治療的靶點(diǎn)篩選

10、 ERK1/2在腫瘤發(fā)生過程的作用 ERK1/2及其通路成員在多數(shù)腫瘤中過表達(dá)或突變。 ERK1/2參與細(xì)胞周期調(diào)控。 ERK1/2參與細(xì)胞外基質(zhì)MMP-9 的表達(dá)調(diào)控。 ERK1/2參與腫瘤化療耐藥的作用。 RNAi是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)打擊的理想方法Andrew Z. Fire (Stanford University photo) Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School )Tree of RNA TypesDiscovery of RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. co

11、ntrol UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizationMechanism of RNAidsRNA22nt siRNAstargetmRNAsecondary siRNAsamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingMechanism of RNAiC. elegansDrosophilaArab

12、idopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRPDicersiRNA5353RISCEffector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activationExamples of RNAihairpin

13、against pigmentGFP expressed in nucleiControl dsRNAGFP specific dsRNARed = silencing of GFPsiRNA針對RISC理性設(shè)計(jì) 從起始密碼下游50100nt開始，避開5或3端的UTRs, 搜索AA(N19)序列。 有義鏈1位為G或C,19為A或U,雙鏈5端能量應(yīng)該比3端 高,即有義鏈15-19至少有3個(gè)A或U,或著13-19至少有5個(gè)A 或U。此原則最為重要。 siRNA5端必須磷酸化,3端懸垂兩個(gè)UU。 對mRNA目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,排除那些作用于復(fù)雜 二級結(jié)構(gòu)的siRNA序列。 Blast對照,并進(jìn)

14、一步用mRNA相似性軟件或脫靶控制軟件 篩選,把脫靶控制到最小水平。 避免出現(xiàn)連續(xù)的多個(gè)G或C,GC含量最好在30%-52%之間,16 位最好為C,13位最好為非G。 遺傳 2006，28（11）：1457-61siRNA-針對RISC理性設(shè)計(jì) 二級結(jié)構(gòu)遺傳 2006，28（11）：1457-61siRNA-針對RISC理性設(shè)計(jì) siRNA的不對稱性遺傳 2006，28（11）：1457-61siRNA的-針對RISC理性設(shè)計(jì)argo蛋白的結(jié)構(gòu)域遺傳 2006，28（11）：1457-61Chemically synthesized SiRNAAdvantagesNo hands-on tim

15、ePurity of siRNA:97% by PAGE or HPLCSynthesis can be scaled upCan be labeledPotential therapeutic useDisadvantagesDuration:inappropriate for knock-out modelPrice:oligo synthesizer, starting materialIn Vitro Transcribed siRNAsIn Vitro Transcribed siRNAsAdvantagesPriceShorter turn-around timeDisadvant

16、agesMore hands-onScalabilityPurityLower specificityIf long transcripted RNA, cocktail SiRNA usedVector-based SiRNAVectors expressing siRNAsU6H1siRNAVectors expressing siRNAsU6Sense sequenceAnti-sense sequenceHair-pin loopSense sequenceAnti-sense sequenceRNAi 體內(nèi)合成用各種載體的比較載 體費(fèi)用長 處短 處質(zhì) 粒低可以比較簡單地大量制備RNA

17、i效果持續(xù)時(shí)間短，導(dǎo)入效率低腺 病 毒高導(dǎo)入效率高，可感染靜止期的細(xì)胞RNAi效果持續(xù)時(shí)間短，制備病毒較費(fèi)時(shí)間逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒中RNAi效果持續(xù)時(shí)間長不能感染靜止期的細(xì)胞RNAi 合成的方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價(jià)格高已找到最有效siRNA，大量篩選體外轉(zhuǎn)錄毒性小，穩(wěn)定 性好，效率高篩選大量，特定用RNAIII消化長片段節(jié)省快速而經(jīng)濟(jì)的研究某基因缺失表型不宜特定的siRNA研究，基因沉默體內(nèi)表達(dá)價(jià)格較高，常用特定siRNA，穩(wěn)定篩選 RNAi是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)打擊的理想方法Huang C, Liu LY, Li ZF, Wang P, Ni L, Song LP, Xu DH, Song

18、 TS. Effects of small interfering RNAs targeting MAPK1 on gene expression profile in HeLa cells as revealed by microarray analysis. Cell Biol Int. 2008,32:1081-1090 RNAi是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)打擊的理想方法 RNAi是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)打擊的理想方法 本研究證明，siRNA有效抑制了MAPK P42的表達(dá)，并為腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。 腫瘤特異性表達(dá)系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)打擊的前提國家自然科學(xué)基金（嵌合式腫瘤特異性啟動子調(diào)節(jié)的ERK1/2 shRNA在肝癌基

19、因治療中的實(shí)驗(yàn)研究，起止年月2009.120011.12，批準(zhǔn)號：30872481。黃辰，主持人。）陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（啟動子調(diào)控的MAPK p42/44 shRNA胰腺癌治療中的實(shí)驗(yàn)研究，起止年月2007.12009.12，批準(zhǔn)號： 2006K09-G7-1。黃辰，主持人。）申報(bào)發(fā)明專利兩項(xiàng)（siRNA篩選系統(tǒng)的通用性綠色熒光蛋白融合靶基因表達(dá)載體，申請?zhí)枺?00710017857.4；腫瘤特異性啟動子調(diào)控的串聯(lián)miRNA或shRNA表達(dá)載體，申請?zhí)?200910022879.9)miRNA DetailsOriginate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA)Hairpin precursor 70 nt (pre-miRNA)Mature miRNA 22 nt