葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值13C12C測定方法液相色譜聯(lián)用穩(wěn)定

1、葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值13C尸2c測定方法液 相色譜聯(lián)用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制說明一、工作簡況.任務(wù)來源本項目是根據(jù)工業(yè)和信息化部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計劃（工信廳科 2013217號），計劃編號為 2013-1875T-QB,項目名稱葡萄酒中 甘油穩(wěn)定碳同位素比值13C/12C測定方法 液相色譜聯(lián)用穩(wěn)定同位素 比值質(zhì)譜法進(jìn)行制定，本標(biāo)準(zhǔn)由全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心歸口，中 國食品發(fā)酵工業(yè)研究院等單位負(fù)責(zé)起草。.目的和意義甘油是構(gòu)成葡萄酒干浸出物的重要成分，是葡萄酒釀造過程中酵 母發(fā)酵產(chǎn)生的副產(chǎn)物。甘油對改善葡萄酒甜味、提升葡萄酒的口感具 有重要作用，但為保證葡萄酒的產(chǎn)品特性，不論歐盟還是

2、我國均禁止 人為地往葡萄酒中添加甘油。當(dāng)前國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T15039葡萄酒、果酒通用分析方法中未涉及甘油的檢測方法，難以對葡萄酒中甘油 的含量、來源進(jìn)行有效監(jiān)管。國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）為追溯葡萄酒中各成分的來源時 廣泛采用了先進(jìn)的穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法，相對于常規(guī)檢測法，該法技術(shù)特異性強(qiáng)，具有較高的應(yīng)用價值。甘油穩(wěn)定碳同位素比值分析方 法目前已被 OIV （Resolution OIV/OENO 343/2010）采納為標(biāo)準(zhǔn)方法。 因此，制定我國葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值測定方法對于檢測甘 油來源、鑒別葡萄酒真實性具有重要意義，有利于維護(hù)我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。.簡要編制過程根據(jù)工業(yè)

3、和信息化部辦公廳下達(dá)的2013輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計劃，葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值 13C/12C測定方法液相色譜 聯(lián)用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院牽 頭組織制定。起草工作組查閱國際上有關(guān)葡萄酒中甘油碳同位素比值 測定的文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，通過對測定原理的梳理與理解，分別開發(fā)了氣相 色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)和液相色譜-穩(wěn)定 同位素比值質(zhì)譜儀(LC-IRMS)測定葡萄酒中甘油碳同位素比值的方 法，從重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、可推廣性方面進(jìn)行了驗證，進(jìn)行數(shù) 理統(tǒng)計與分析，為標(biāo)準(zhǔn)研究提供足夠的數(shù)據(jù)支持，并從中選擇液相色 譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法為測定葡萄酒

4、甘油穩(wěn)定碳同位素組成的標(biāo) 準(zhǔn)方法。根據(jù)這些據(jù)，并結(jié)合批準(zhǔn)文件中的指標(biāo)規(guī)定，我們編制了葡 萄酒中甘油碳同位素比值測定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)初稿。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要內(nèi)容1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)以科學(xué)技術(shù)和實驗數(shù)據(jù)為依據(jù)，經(jīng)過科學(xué)研究而制定。本標(biāo)準(zhǔn)的制定充分考慮規(guī)范行業(yè)發(fā)展，促進(jìn)穩(wěn)定同位素食品分析技術(shù)的 進(jìn)步，加強(qiáng)行業(yè)監(jiān)管能力，充分考慮國內(nèi)相關(guān)的法規(guī)要求；與相關(guān)標(biāo) 準(zhǔn)法規(guī)協(xié)調(diào)一致；結(jié)合國內(nèi)分析領(lǐng)域的實際情況，確保標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性、 先進(jìn)性、可操作和可推廣性。本標(biāo)準(zhǔn)起草過程中，主要按 GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫和 GB/T 1.2-2002標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 2部分：標(biāo)準(zhǔn)

5、中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法進(jìn)行編寫。主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀測定葡萄酒中甘 油穩(wěn)定碳同位素比值的方法；本標(biāo)準(zhǔn)適用于葡萄酒及其他物質(zhì)中甘油碳同位素比值的測定，連續(xù)2次重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差SEX 0.20%. 三、主要試驗(或驗證)情況分析針對葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究， 詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)見附件一。(1)用氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法測定葡萄酒中甘 油穩(wěn)定碳同位素比值，雖然該方法具有較好穩(wěn)定性，但驗證過程中發(fā) 現(xiàn)葡萄酒中甘油含量會顯著影響測定結(jié)果， 需經(jīng)過嚴(yán)格校正方可得到 甘油的穩(wěn)定碳同位素比值，該過程增加了分析難度，因此不建議將本 法采納

6、為方法標(biāo)準(zhǔn)。(2)建立了液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜測定葡萄酒中甘油碳 穩(wěn)定同位素比值的方法，并對方法的便利性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均進(jìn)行 了驗證。其中連續(xù)5次的標(biāo)準(zhǔn)偏差SDC 0.15%。，連續(xù)2次測定的 SDC 03%。，方法的穩(wěn)定性符合國際要求；利用加標(biāo)法驗證方法的準(zhǔn)確 性，測定結(jié)果與預(yù)測值無顯著性差異。四、標(biāo)準(zhǔn)中涉及的專利無。五、產(chǎn)業(yè)化情況、推廣應(yīng)用論證和預(yù)期達(dá)到的經(jīng)濟(jì)效果等情況 葡萄酒作為世界通暢型酒種，以其健康時尚的文化內(nèi)涵逐漸被我 國消費(fèi)者認(rèn)可，作為國家酒類產(chǎn)業(yè)四個轉(zhuǎn)變”政策中大力扶持和發(fā)展的酒種，近幾年我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)一直保持良好的發(fā)展態(tài)勢。2016年全國葡萄酒產(chǎn)量為113.7萬升，進(jìn)

7、口葡萄酒總量約為63.8萬千升，同比增長15%。盡管葡萄酒中本來就含有一定量的甘油，而且食品 級甘油是一種合法添加劑，但不論是歐盟還是我國，都禁止人為地往 葡萄酒中添加甘油。但添加外源甘油改善葡萄酒口感和質(zhì)量的事件時 有發(fā)生，影響了葡萄酒的品質(zhì)、聲譽(yù)，也是葡萄酒行業(yè)健康發(fā)展的隱 患。制定此項分析方法標(biāo)準(zhǔn)將為葡萄酒行業(yè)研究葡萄發(fā)酵產(chǎn)生甘油的 碳同位素特征、構(gòu)建葡萄酒的的同位素指紋圖譜提供方法參考依據(jù)， 對規(guī)范我國葡萄酒行業(yè)有序競爭，防止國外劣質(zhì)葡萄酒傾銷具有重要 意義，具有顯著社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。六、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)情況，與國際、國外同類標(biāo)準(zhǔn)水 平的對比情況，國內(nèi)外關(guān)鍵指標(biāo)對比分析或與

8、測試的國外樣品、 樣機(jī)的相關(guān)數(shù)據(jù)對比情況本標(biāo)準(zhǔn)修改采用了國際葡萄與葡萄酒組織(OIV)的方法標(biāo)準(zhǔn)： Resolution OIV/OENO 343/2010: Method for the determination of the 13C/12C isotope ratio of glycerol in wines by Gas Chromatography Combustion or High performance Liquid Chromatography coupled to Isotopic Ratio Mass Spectrometry (GC-C-IRMS or HPLC-IRM

9、S)。七、與現(xiàn)行相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，特別是強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn) 的協(xié)調(diào)性該標(biāo)準(zhǔn)從我國穩(wěn)定同位素食品分析領(lǐng)域的實際情況出發(fā)，參考了國內(nèi)外相關(guān)資料，體現(xiàn)了科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性原則，在制定過 程中充分考慮國內(nèi)相關(guān)的法規(guī)要求，結(jié)合葡萄酒行業(yè)的特點(diǎn)，與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)包括強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。八、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無重大分歧意見。九、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)的建議說明葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值13C/12C測定方法 液相色譜聯(lián) 用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法為推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。十、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議在本標(biāo)準(zhǔn)通過審核、批準(zhǔn)發(fā)布之后，由相關(guān)部門組織力量對本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宣貫，在行業(yè)內(nèi)進(jìn)行推廣。建議本標(biāo)準(zhǔn)自發(fā)布 6個月之后

10、開始 實施。十一、廢止現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議無。十二、其它應(yīng)予說明的事項該標(biāo)準(zhǔn)從我國白酒行業(yè)的實際情況出發(fā)，參考了國內(nèi)外相關(guān)資料，體現(xiàn)了科學(xué)性、先進(jìn)性和可操作性原則，綜合評定達(dá)到了國際水 平。葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值13C/12C測定方法 液相色譜聯(lián)用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)起草工作組2017年4月附件一葡萄酒中甘油穩(wěn)定碳同位素比值(13C/12C)測定方法驗證一、研究背景葡萄酒以其健康時尚的文化內(nèi)涵逐漸被我國消費(fèi)者認(rèn)可，成為酒類行業(yè)最具 發(fā)展空間和潛在消費(fèi)市場的酒種。作為國家酒類產(chǎn)業(yè)“四個轉(zhuǎn)變”政策中大力扶持和發(fā)展的酒種，近幾年我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)一直保持良好的發(fā)展態(tài)勢，已成為全球 第五大葡

11、萄酒消費(fèi)國和第六大葡萄酒生產(chǎn)國，同時我國也是世界第六大葡萄酒進(jìn) 口國。大力發(fā)展我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)，可大幅提高葡萄種植業(yè)的附加值，實現(xiàn)農(nóng)戶增產(chǎn)、 增收愿望，符合我國食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整需要。數(shù)據(jù)顯示2016 年中國的葡萄酒零售市場價值約為 780億元，全國葡萄酒產(chǎn)量達(dá)到了 113.7萬升。 然而葡萄酒產(chǎn)業(yè)快速增長的背后，產(chǎn)品質(zhì)量問題也層出不窮，”三精一水勾兌的葡萄酒”產(chǎn)業(yè)鏈屢次被央視曝光，葡萄酒產(chǎn)地、年份虛假標(biāo)注屢禁不止。尤其是近年來受主流消費(fèi)者轉(zhuǎn)變、海外直采比重增加和“零關(guān)稅”政策等因素的影響， 進(jìn)口葡萄酒正快速蠶食過程葡萄酒的市場份額，擠壓國產(chǎn)酒的利潤空間，但進(jìn)口葡萄酒的質(zhì)量安全問

12、題也層出不窮。葡萄酒產(chǎn)品真實性問題帶來了嚴(yán)重的食品安 全隱患，破壞了我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)誠信體系和品牌形象， 阻礙了中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā) 展和民族品牌企業(yè)的發(fā)展，也會導(dǎo)致一系列經(jīng)濟(jì)社會安全問題。甘油是葡萄酒中干浸出物的主要化合物，是酒精發(fā)酵的正常副產(chǎn)物。甘油賦 予了葡萄灑灑體豐滿的特征-不僅可以增加葡萄酒的甜度，而且使得葡萄酒口感 更厚重圓潤，因此一些歐洲國家也將甘油作為葡萄酒評級的依據(jù)。然而， 葡萄發(fā) 酵產(chǎn)生的的甘油含量會受葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候、品種與成熟度、酵母菌種與接種量、 葡萄含糖量與pH、含氮化合物、SO2添加量、發(fā)酵溫度等多種因素的影響，有 時候由于葡萄質(zhì)量不好，或者發(fā)酵出了問題，會導(dǎo)致生產(chǎn)出來的

13、葡萄酒口感較差， 一些不法酒商會人為地往葡萄酒中添加甘油來改善葡萄酒的口感，更有甚者直接用工業(yè)甘油和三精一水化學(xué)原料生產(chǎn)“葡萄酒”。但這種非法添加行為在歐盟(EEC) NO. 822/87和我國都是被嚴(yán)格禁止的，因此，建立葡萄酒中外源添加甘 油的檢測方法對葡萄酒質(zhì)量安全工作具有重要意義。作為一種C3植物，葡萄及其發(fā)酵產(chǎn)物的碳同位素特征不同于 C4植物和石化 產(chǎn)品，因此可以通過分析甘油的碳同位素特征來檢測外源添加的甘油。2004年,Giovanni等人報道了建立了氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜法 (GC-C-IRMS)測定葡萄酒甘油的方法，分析了歐盟部分國家的葡萄酒中甘油 碳同位素特征，該方

14、法被國際葡萄與葡萄酒組織(OIV)采納為分析葡萄酒甘油 碳同位素比值的第一方法(Resolution OIV/OENO 343/2010 )，該法的分析精度 (SD)僅為0.6%,然而關(guān)于各因素對準(zhǔn)確分析的影響卻未見報道；國內(nèi)李學(xué)民 和吳浩等人使用該技術(shù)分析了國內(nèi)葡萄酒的甘油W3C特征，結(jié)果表明該方法的精度可優(yōu)于0.4%,但準(zhǔn)確性稍差。2010年，Caba兔ro使用液相色譜-穩(wěn)定同位 素比值質(zhì)譜法(LC-IRMS)測定葡萄酒甘油N3C,精度可優(yōu)于0.3%,而準(zhǔn)確度 方面與GC-C-IRMS比也具有一致性，因此OIV將其作為第二法采納為方法標(biāo)準(zhǔn)。 本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，鑒于 GC-C-IRMS和LC

15、-IRMS能夠?qū)崿F(xiàn)自動進(jìn)樣分析從而 提高分析效率、減輕操作人員的壓力，因此分別對這兩種方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性 和可推廣性方面進(jìn)行驗證。二、測定原理及主要指標(biāo)測定原理甘油在排除有機(jī)物干擾的情況下被轉(zhuǎn)化成 CO2氣體，經(jīng)干燥后導(dǎo)入穩(wěn)定同位 素比值質(zhì)譜儀并測定得出甘油的辭C值，其分析過程可歸結(jié)為以下步驟：在確保無同位素分儲或分儲系數(shù)可控的條件下，有效分離甘油與其他有機(jī) 物；將甘油轉(zhuǎn)化成CO2氣體；除去大部分水分后將CO2氣體導(dǎo)入穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀的離子源中；將CO2氣體轉(zhuǎn)變?yōu)殡姾蔀閑的陽離子(CO2+),應(yīng)用縱電場將離子束準(zhǔn)直 成為一定能量的平行離子束；利用電、磁分析器將離子束分解成不同M/e比值的

16、組分；測定并記錄每組離子束的強(qiáng)度；應(yīng)用計算機(jī)程序?qū)㈦x子束強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為同位素豐度；將該同位素豐度與測得的工作參考?xì)怏w的同位素豐度比較，得出于C測定值；將該樣品甘油的 W3C測定值與參考物質(zhì)對比得出其真實的穩(wěn)定碳同位素比值NCpdb。主要指標(biāo)排除葡萄酒中乙醇、乳酸等有機(jī)物的干擾；適用各種濃度范圍的含甘油樣品；精密度SD,重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差r 270c 和300c時進(jìn)樣，每個試樣進(jìn)樣3次，甘油經(jīng)GC-C-IRMS轉(zhuǎn)化的CO2的信號強(qiáng) 度（m/z44）見圖1, W3C結(jié)果見表1。進(jìn)樣口溫度（七）3邕巾埋圖1不同進(jìn)樣口溫度時甘油轉(zhuǎn)化的 CO2的信號強(qiáng)度（m/z44）表3甘油在不同進(jìn)樣溫度下的 W3C測定結(jié)果（

17、%）進(jìn)樣口溫度200 c240 c270 c300 cWS-1-27.63 0.14-27.45 0.10-27.80 0.10-27.83 0.16WS-2-24.33 0.18-24.04 0.18-24.15 0.13-23.64 022WS-3-21.11 028-20.85 021-20.88 0.17-20.49 024Wine-01-24.13 (t09-24.05 020-23.96 0.19-23.84 004A 13C(ws-2)-(ws-i)3.303.513.654.01a 13- C(WS-3)-(WS-1)6.436.706.927.34從圖1可出，GC-C-IRM

18、S分析甘油碳同位素組成時，甘油產(chǎn)生的 CO2的信 號強(qiáng)度（m/z44）因進(jìn)樣口溫度不同而有差異：三個甘油標(biāo)品均溶于純乙醇中， 在240c時信號強(qiáng)度達(dá)到最大值，在 240c到270c時無變化，然而葡萄酒樣品 的甘油信號強(qiáng)度卻只在270c時呈現(xiàn)出最大值；進(jìn)樣口溫度高于 270c時甘油信 號強(qiáng)度降低，可能是由于溫度太高導(dǎo)致甘油分解，或者是乙醇、水等其他低沸點(diǎn)物質(zhì)的蒸汽分壓太大，270c時甘油的氣化占比變小，進(jìn)入色譜柱的比例也因之 降低的緣故。對比不同進(jìn)樣口溫度時的 W3C結(jié)果可知：200270c時S3C測定結(jié)果無明顯 差異（極差 0.3%）,但300c時呈現(xiàn)出偏正的趨勢，而分析精度普遍在 0.04%

19、 0.3%之間?？紤]到葡萄酒樣品（Wine-01）在270c時的具有更高的信號強(qiáng)度 （m/z44）,后續(xù)研究中均設(shè)定進(jìn)樣口溫度為 270C。需要注意的是，WS-1、WS-2和 WS-3的 Ncvpdb分別為-30.98 0.05%、 -27.95仕04%和-25.08仕04% ,而200270c時三個標(biāo)樣的W3C實測均值分別為 -27.63仕17%、-24.17仕15%和-20.95比14%,測定值與給定值之間的系統(tǒng)偏差 分別為3.35%、3.78%和4.13%,這說明單純依靠調(diào)整工作參考?xì)?CO2的賦予 值來計算樣品的 及Cvpdb值是不充分的，而應(yīng)該需遵守穩(wěn)定同位素分析的“IT”原則，并依

20、據(jù)Stephen等建立的數(shù)據(jù)模型來校正：三個標(biāo)樣的測定值與給定值之 間的線性擬合程度R2=1,這說明該分析條件（進(jìn)樣口 270C、色譜柱240c恒溫、 分流進(jìn)樣10:1）下甘油碳同位素分儲特征是線性的、分儲系數(shù)是固定的，因此可以采用兩點(diǎn)校正法，任取兩個標(biāo)樣的測定值和給定值建立回歸曲線，如 WS-1和WS-2之間的線性擬合公式為 N3Cvpdb=0.8832* W3C-6.5792,由此計算得出 WS-2 的W3Cvpdb值為-27.93%,與Z&定值-27.95%十分接近。柱溫對甘油測定的影響如上文所述，分流進(jìn)樣模式下進(jìn)樣口溫度影響樣品的氣化特征進(jìn)而影響甘油 產(chǎn)生的CO2的信號強(qiáng)度，同樣地，G

21、C-C-IRMS體系中毛細(xì)色譜柱并非直接連在 檢測器上，色譜柱流出的物質(zhì)約有 90%的物質(zhì)轉(zhuǎn)入燃燒管中（其余10%經(jīng)裂解 管排出）。甘油在該節(jié)點(diǎn)處并未100%進(jìn)入燃燒管，因此可能因樣品損失而出現(xiàn) 碳同位素分儲。為驗證色譜柱溫度對甘油 W3C測定的影響，在進(jìn)樣口溫度270C、 載氣流速1.2mL/min的情況下，設(shè)定程序升溫的初始溫度為 80C,保持1min, 然后以30C/min的速度升至180C、200C、220C、240c或260C ,并分別保 持恒溫至分析結(jié)束。甘油乙醇溶液（WS-1、WS-2、WS-3）和葡萄酒（W-01） 分別進(jìn)樣，每個試樣進(jìn)樣3次,甘油經(jīng)GC-C-IRMS轉(zhuǎn)化的CO

22、2的信號強(qiáng)度（m/z44） 見圖2, W3C結(jié)果見表2。色透柱溫度（O圖2不同色譜柱最終溫度時甘油轉(zhuǎn)化的 CO2的信號強(qiáng)度（m/z44） 表4甘油在不同色譜柱溫度下的 W3C測定結(jié)果（%）色譜柱終溫180C200 c220 c240 c260 cWS-1-22.79 028-24.20 M7-26.66 0t72-27.55 0t22-28.70 0b06WS-2-17.67 Qt94-20.51 M1-21.76 041-23.36 0t17-24.99 0t25WS-3-11.95 世72-18.02 029-18.72 0t11-20.11 008-21.86 0t09Wine-01-1

23、7.72 世36-23.33 0.17-23.15 (t06-23.73 009-24.12 比15人13c C(WS-2)-(WS-1)5.123.684.904.193.71A 13C(WS-3)-(WS-1)10.846.177.947.446.84圖2中，各試樣中甘油轉(zhuǎn)化的CO2信號強(qiáng)度（m/z44）隨色譜柱最終溫度的 升高而增加，最大相差近4倍，這表明柱溫影響了甘油流出色譜柱后的分配情況， 溫度越高，越有利于甘油進(jìn)入燃燒管。13表4中，180c220c時甘油6 C測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大（ 0.4%）,分析 其原因，可能是由于甘油的沸點(diǎn)較高，甘油流出色譜柱后或在色譜柱中有一部分 被液化的

24、緣故。根據(jù)同位素?zé)崃W(xué)分儲原理，我們知道溫度越高時同位素越能快 速達(dá)到動態(tài)平衡，甘油在柱溫180c和200c時流入反應(yīng)管的部分與剩余部分可 能未達(dá)到平衡狀態(tài)，因此導(dǎo)致碳同位素測定精度差。240c和260c時甘油W3C的測定重復(fù)性均比較理想（標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 0.25%）,相對于240C,柱溫設(shè)定在 260c時甘油標(biāo)品（乙醇為溶劑）產(chǎn)生的 CO2的信號強(qiáng)度（m/z44）提升有限 （2%5%）,而葡萄酒樣品中甘油的信號強(qiáng)度（m/z44）提高了約9%,這表面 260c的柱溫條件對含水試樣較為有利。穩(wěn)定同位素分析領(lǐng)域，分析系統(tǒng)測定尺度（ sca）對分析準(zhǔn)確性至關(guān)重 要23,由于穩(wěn)定同位素分析誤差的存在（/

25、C00.3%）,我們認(rèn)為，測定尺度 越大，分析誤差對樣品準(zhǔn)確性的影響越小（比如針對兩個物質(zhì)的測定尺度： 實際差值=2,即使分析誤差為0.3%,那么數(shù)據(jù)經(jīng)校正后結(jié)果的誤差則可能僅為 0.15%）。標(biāo)品WS-1與WS-3之間W3Cvpdb差值為5.80%, 180C和220c時差值最大， 但分析精度差；與260c的數(shù)據(jù)相比，240c時兩標(biāo)樣測定值的差異更大一些， 因此選擇盡管260c更有利于提升含水試樣中甘油信號量，但選擇240c作為后續(xù)研究的色譜柱的最終溫度。水分對甘油測定的影響上文研究過程中，葡萄酒和甘油-乙醇溶液在測定時表現(xiàn)出了一些不同， 其原 因可能是由于樣品中溶劑不同導(dǎo)致的： 純甘油樣品

26、的溶劑為純乙醇，而葡萄酒中 則是10%左右的乙醇水溶液。為研究水分對甘油測定的影響，分別配制含水量為 0、20%、40%、60%、80%、90%和100%的乙醇水溶液，配制約 100g/L的甘油乙醇溶液（WS-1和WS-3）,然后分別用不同含水量的乙醇水溶液稀釋至 5g/L, 并在進(jìn)樣口 270 C、流速 1.2mL/min、程序升溫（80 C/1min/30/240 C/5min）條 件下進(jìn)樣測定，每個試樣測定 3次，結(jié)果見圖3和表3。1000vvs-l W5-SD 0204060SO100120溶劑中水分含量(%)圖3不同溶劑中甘油轉(zhuǎn)化CO2的信號強(qiáng)度（m/z44）表5不同溶劑中甘油S3C

27、測定結(jié)果（為）溶劑含水量（v/v）100%90%80%60%40%20%0%-25.58-25.71-26.07-26.65-26.75-27.16-27.5513o Cws-i由08由213.10子.05垃14i0.14由2230 CwS-3-18.30-18.77-19.19-19.55-20.01-19.98-20.11由14由193.10由17垃03i0.20由08A 13C6.005.665.605.825.465.906.22圖3中，CO2信號強(qiáng)度均隨溶液中水分含量的增加而降低，擬合度分析表明相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.98,這表明溶液中水分影響了甘油在 GC中的分配特征。事 實上，同體積

28、同條件進(jìn)樣，水蒸汽的體積是乙醇蒸汽的 3倍多，因此，進(jìn)樣溶液 含水量越高，甘油氣化后占比越低，那么進(jìn)入色譜柱的氣態(tài)甘油也會相應(yīng)減少。表5中所有試樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.21%,說明水分未影響甘油W3C的測定 穩(wěn)定性。但是，各試樣中甘油 及C的分析結(jié)果存在微小差異-測定值隨溶液中含 水量的增加而升高，樣品中的水分影響了甘油的碳同位素分儲情況，此時， 進(jìn)樣 口處含13c較多的甘油分子更容易被轉(zhuǎn)移至色譜柱中。葡萄酒的含水量一般為 84%95%,對比表3數(shù)據(jù)可知，樣品含水量在80%100%波動時，兩個甘油（WS-1 和WS-2) W3C測定值的極差分別為0.49%和0.89%,因此，按照穩(wěn)定同位素分 析

29、的“IT原則，應(yīng)確保工作標(biāo)準(zhǔn)樣品與葡萄酒樣品盡可能地含有相同的水分含 量。甘油濃度對W3C測定的影響葡萄酒中甘油含量受多種因素的影響，最低為 4g/L左右，而最高則可達(dá) 21g/L。為研究甘油濃度對N3C測定的影響，模擬葡萄酒中酒精含量，以12%(v/v) 乙醇水溶液為溶劑配制濃度為3g/L21g/L的甘油樣品，并分別直接進(jìn)樣測定/C,結(jié)果見表6。表6不同濃度下甘油S13C測定結(jié)果(%)甘油濃度(g/L)36912151821N 3CwS-1-25.37i0.54-25.4410.24-25.37垃11-26.063.14-26.44W.07-26.31由15-26.21i0.16130 Cw

30、S-2-22.18由40-22.6510.16-22.71垃23-23.023.10-23.44W.15-23.44由12-23.27i0.27130 CwS-3-18.681.68-19.9210.28-20.18垃19-20.483.14-20.61i0.20-20.82M.28-20.51i0.14峰面積(A)3.89由6914.512.3426.25=d.5249.82垃1060.35d8.2470.7261877.37i0.64信號強(qiáng)度(mV)50221424592863699481190913994由表6可知：甘油濃度與色譜峰峰面積可知回歸分析表明峰面積與甘油濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(

31、R2=0.978),然而當(dāng)甘油濃度加倍時，甘油轉(zhuǎn)化的CO2的m/z 44的峰面積卻增加了不止一倍，峰面積的增長率為4.37A/(g/L); S3C測定結(jié) 果與甘油含量呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系 (R2為0.680.84),而且甘油的13C含量越多， /C測定值因濃度而變化的特征越顯著，因此，測定結(jié)果進(jìn)行后續(xù)處理時需考慮 樣品中甘油濃度，并選用W3Cvpdb值相近的標(biāo)品，或先建立的數(shù)學(xué)模型然后再有 針對性的進(jìn)行數(shù)據(jù)校正?？紤]到IRMS有效測定時對信號強(qiáng)度的要求，推薦進(jìn)樣時甘油濃度為69g/L,但是，葡萄酒中甘油含量一般為410g/L, GC-C-IRMS需對高濃度樣品稀釋，低 濃度樣品若直接進(jìn)樣會使得大量

32、水分進(jìn)入色譜柱，影響色譜柱壽命，而對低濃度樣品富集則增加了分析難度。進(jìn)樣口溫度、色譜柱溫度等硬件設(shè)備的條件可很方 便地調(diào)節(jié)、設(shè)置，但是樣品甘油濃度、水分含量以及選擇與樣品 W3Cvpdb值相近 的甘油標(biāo)品卻是準(zhǔn)確分析最關(guān)鍵的影響因素，因此我們認(rèn)為應(yīng)用GC-C-IRMS分析甘油碳同位素特征時難度較大，不便于推廣使用。LC-IRMS測定甘油W3C方法研究實驗部分儀器與試劑液相色譜-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（LC-IRMS）:美國ThermoFisher公司的 MAT 253同位素質(zhì)譜儀，配備IsoLink接口與Dionex液相色譜。LC-IRMS使用的超純水由Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)

33、制備。正磷酸（純度99%）、過二硫酸鈉（純度99%）均購于Sigma-Aldrich 公司；濃硫酸購置于國藥集團(tuán)。保護(hù)氣和載氣為氮?dú)猓兌?9.999%）,購于北京市北溫氣體制造廠； 工作參考?xì)猓憾趸迹兌?9.99%）,購于北京市北溫氣體制造廠。配制0.2mol/L磷酸溶液和0.2mol/L過二硫酸鈉溶液，存于棕色瓶內(nèi)，用前 使用真空抽濾裝置除雜、用超聲波脫氣。蔗糖IAEA-CH-6 （ 613CPDB值為-10.450.2%）購于奧地利維也納國際原 子能機(jī)構(gòu)，作為碳穩(wěn)定同位素比值分析的參考物質(zhì)。樣品蘋果酸、檸檬酸、乳酸、葡萄糖、蔗糖、果糖和甘油購自sigma試劑公司。乙醇（色譜純）購自

34、國藥集團(tuán)。樣品處理使用超純水將樣品稀釋至乙醇濃度約 0.27g/L,用0.22叱m尼龍濾膜過濾， 轉(zhuǎn)移至樣品瓶中供LC-IRMS測定乙醇613C值。實驗條件LC-IRMS 條件：色譜柱為 Hyper REZ XP Carbohydrate H+柱（300mmX7.7mm, 8 pm, ThermoFisher公司)；流動相為0.0005M硫酸溶液，流速為300仙L/min ;柱溫為60C,進(jìn)樣體積為10仙L。磷酸溶液和過兒硫酸鈉溶液作為反應(yīng)助劑，流速為0.05mL/min以將色譜分離的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成CO2。3.3.2結(jié)果與討論OIV方法中推薦使用 HyperREZ Carbohydrate H+

35、色譜柱用于葡萄酒甘油分 析，國內(nèi)李學(xué)民等人對比了 Phenomenex Rezex RCM Ca2+)和 Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid (H+)分離甘油和乙醇的效果，其中 Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid (H+)具有較好的分離效果。本項目采用HyperREZ Carbohydrate H+開展了后續(xù)研究。甘油保留時間乙醇和甘油是葡萄酒中最重要的兩大有機(jī)組分，有報道顯示色譜柱和流動相 的選擇會影響二者的分離效果。為驗證 HyperREZ Carbohydrate H+對乙醇和甘油 的分離能力，配制乙醇和甘油的溶液并進(jìn)樣測定

36、，結(jié)果見圖 4。圖4甘油和乙醇W3C的離子流圖圖4顯示了甘油與乙醇的離子流圖，可以看出保留時間分別為1793s1943s和2698s2835sl二者的分離度良好，因此分析過程中可排除乙醇對甘油的干擾。然而葡萄酒中的有機(jī)物并非只有甘油和乙醇，還有諸多的有機(jī)酸以及可能存 在少量的糖，我們在分析葡萄酒樣品時也確實發(fā)現(xiàn)甘油峰前面有一雜峰(見圖5)。經(jīng)過單標(biāo)驗證，我們確定該位置的有機(jī)物為乳酸，其與甘油保留時間比較接近， 而其他有機(jī)酸和糖類的保留時間與甘油相差甚遠(yuǎn)，而乳酸即便與甘油接近，也存在4s的間隔，不會干擾甘油的測定，并且葡萄酒樣品中乳酸含量只占甘油含量 的1/10左右，因此其對甘油的影響可以忽略。

37、圖5葡萄酒樣品中甘油N3C的離子流圖流動相選擇基于LC-co-IRMS的分析特性，其流動相不能含有任何有機(jī)組分，而流動相 的理化特性對分離效果影響甚大。HyperREZ Carbohydrate H+不能使用含無機(jī)鹽的流動相，而文獻(xiàn)中報道較多的則是以硫酸溶液作為流動相，因此本研究針對純水和不同濃度的硫酸溶液展開分析。表7不同濃度硫酸溶液作為流動相時的甘油保留時間硫酸濃度(mM/L)起始時間(s)3C 值(%o)01795-31.270.51798-31.2551802-31.05501802-31.45由于液相流動相管道對酸堿的耐受極限是 pH=2,因此研究中我們僅對 25mM以下的硫酸溶液進(jìn)

38、行了驗證。正如表7所示，流動相中硫酸濃度只對甘油 的保留時間有輕微影響，隨著濃度升高，甘油的保留時間稍微后延，對Nc測定結(jié)果也無影響。然而，研究中發(fā)現(xiàn)，盡管流動相的酸濃度不影響甘油的峰形， 但是對該色譜柱上甘油相鄰物質(zhì)-乳酸的影響極大，純水流動相時會造成乳酸出 現(xiàn)前沿峰而有可能會影響甘油的分離，而 0.5mM濃度時乳酸色譜峰變得比較對 稱，5mM時呈正態(tài)分布。因此，確定流動相為 5mM的硫酸溶液。色譜柱溫度選擇有文獻(xiàn)指出色譜柱溫度會影響待測組分的氧化效率， 然而，我們分別在30C、 45 c和60 c條件下分離甘油，測定結(jié)果見表 8。表8不同溫度下甘油各指標(biāo)的 度C測定結(jié)果類別編號柱溫30 C

39、柱溫45 C柱溫60 C保留時間(s)WS-11802.21809.91811.2WS-21802.81809.31807.8WS-31799.91806.41807.2峰面積（mA）WS-166.76763.44760.443WS-268.30266.19769.656WS-396.02597.27394.52583C測定值（先）WS-1-31.05-30.91-31.07WS-2-27.98-28.19-28.13WS-3-24.97-24.93-24.81由上表可知，應(yīng)用本色譜柱時，不同溫度條件下保留時間、峰面積及及C值并未出現(xiàn)明顯變化，這說明上述分析指標(biāo)不受色譜柱溫度的影響，尤其是峰面積接近，說明溫度未影響甘油的氧化效率。雖然各甘油標(biāo)樣W3C測定值與的給定值存在一定差異，但相關(guān)分析表明二者的線性擬合度R2均大于0.99,這說明測定過程中出現(xiàn)的系統(tǒng)偏差是固定的，可以通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)校 正。方法精密度分別選取甘油標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) WS-1,以及紅白葡萄酒樣品各一個，分別