抗遲緩愛德華菌獨特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列分析

1、抗緩慢愛德華菌奇特型單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆及序列闡發(fā)秦紅,黃威權，楊向民,溫偉紅,楊安鋼、【關鍵詞】緩慢愛德華菌;,抗奇特型抗體;,基因克隆;,序列闡發(fā)摘要目的:克隆并闡發(fā)緩慢愛德華菌抗奇特型單克隆抗體AbVH基因。要領:從排泄緩慢愛德華菌抗奇特型Ab的雜交瘤細胞株1E11中提取總RNA,利用RTPR技能,擴增緩慢愛德華菌抗奇特型抗體VH基因,并將其克隆到PBSTvetr中舉行序列闡發(fā)。效果:VH基因的全長序列為339bp,編碼113個氨基酸。通過NBI/BLAST/N和IGT數據庫Lefrane,2001闡發(fā)表白,VH基因切合小鼠IgGV區(qū)基因的特性:含有4個框架區(qū)FR,3個抗原互補

2、決定區(qū)DR及兩個抗體特性性的半胱氨酸。結論:樂成地克隆了緩慢愛德華菌抗奇特型AbVH基因,為進一步構建緩慢愛德華菌抗奇特型抗體基因工程疫苗奠基了基矗關鍵詞緩慢愛德華菌;抗奇特型抗體;基因克隆;序列闡發(fā)緩慢愛德華菌(Edardsiellatarda)是淡、海水養(yǎng)殖魚類的一種最重要的病原菌1,具有很強的致病性,其熏染具有盛行面積廣、發(fā)病率及殞命率高等特點,是水產養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的一種疾玻該菌的宿主范疇較普及,常能從多種冷血動物、鳥類、溫血脊椎動物及情況中分散出2,可引起人類的種種熏染胃腸炎、敗血癥、肝膿腫、腦膜炎、傷口熏染等。臨床表示為腹瀉、水樣便、伴吐逆、腹痛及低熱等。別的,亦有報道緩慢愛德華菌

3、可引起肝膿腫、腦膜炎及軟構造熏染等的報道3。如今,海內對該菌的治療仍舊是應用種種抗生素等藥物,如在餌料中添加適量的土霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺類藥物等,并按期用福爾馬林藥裕但恒久應用抗生素易產生耐藥性和藥物殘留等負面影響4,5。歐、美等國度已有將弧菌、氣單胞菌及愛德華菌等制成滅活疫苗,并從中提取多糖、胞外卵白等有用抗原,制備了單克隆抗體Ab工程疫苗,且已商品化消費。由于滅活疫苗的抗原性較弱,而減毒疫苗的寧靜性不不變,為此,研制利用便利、高效、易商品化大范圍消費、實在有用的疫苗,對水財產甚為需要。我們初次從排泄抗緩慢愛德華菌奇特型Ab的雜交瘤細胞株1E11中提取總RNA,并以

4、RTPR樂成克隆了該Ab的VH基因。1質料和要領1.1質料排泄抗緩慢愛德華菌奇特型Ab的雜交瘤細胞株1E11為本室創(chuàng)立6。RPI1640干粉為GibBRL公司產物。RNA抽提試劑TRIzlTReagents購自TaKaRa公司。RTPR試劑盒為美國Invitrgen公司產物。質粒提取試劑盒和膠接納試劑盒,均購自北京博大泰克公司。PR試劑,毗連試劑和pBSTvetr均購自北京天為期間公司。1.2要領緩慢愛德華菌抗奇特型AbVH基因的擴增:清醒排泄抗緩慢愛德華菌奇特型Ab的雜交瘤細胞株1E11,傳至3代使細胞數量達2.8107/L后勞績細胞。用TRIzlTReagents、氯仿和異丙醇抽提RNA后

5、,以無水乙醇沉淀。以11LRNA為模板,以ligdT20為隨機引物,反轉錄合成DNA第1鏈。PR引物序列:Bak:5ATGAAATGAGTGGGGAT(,G)TTTT3;Fr:5AGTGGATAGAAGATGGGGG3。在25L反響體系中,參加DNA2L,Bak和Fr引物各1L舉行PR。反響參數為:于94變性5in后,94、1in,50、1in,72、1in,共25次循環(huán)后,于72再延伸10in。PR產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳斷定。2效果2.1RTPR擴增產物的斷定經10g/L瓊脂糖凝膠電泳斷定表白,VH基因的RTPR產物巨細為420500bp圖1。圖1Ab1E11VH基因RTPR產物的瓊

6、脂糖凝膠電泳闡發(fā)略1:DL2000DNAarker;2:VH基因的RTPR產物.2.2VH基因的克隆及序列闡發(fā)將PR擴增的VH基因膠接納后,克隆入pBSTvetr載體中,并轉化E.liDH5的感覺態(tài)細胞中,經Xgal藍白挑選后,挑取陽性克隆,經菌落PR斷定準確后舉行測序。測序效果經IGT數據庫Lefrane,2001闡發(fā)表現(xiàn),VH基因具有小鼠IgGVH基因的特性,含有3個DR區(qū),4個FR區(qū)和兩個抗體特性性的半胱氨酸(圖2)。圖2抗緩慢愛德華菌奇特型AbVH基因的核苷酸及推導的氨基酸序列略3討論克隆得到準確的抗體輕、重鏈可變區(qū)基因,是制備基因工程抗體中最緊張也是最關鍵的一步。由于在RTPR而得到

7、的雜交瘤細胞株的DNA中,一些非復制的重排片斷是最正確的PR模板;并且在舉行細胞融適時大概交融不止一個脾細胞至骨髓瘤細胞,從而導致多種成效性以及非成效性V區(qū)基因產生。因此在做PR克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)基因時,大概會克隆出除目的基因以外無關的輕重鏈基因。別的,由于V區(qū)基因內部的5端和3端的突變大概會按捺引物退火而攔阻擴增反響。因此我們接納了抗體重鏈可變區(qū)基因5端的信號肽,及3端恒定區(qū)的通用引物,通過NBI/BLAST/N和IGT數據庫Lefrane,2001將PR出的基因序列舉行闡發(fā),尋出抗體重鏈可變區(qū)的基因序列,并在盤算機上舉行Blast綜合闡發(fā),顛末以上研究事情的重復論證,以確保抗體重鏈可變

8、區(qū)基因的完備和正確。效果,通過Blast闡發(fā)未見雷同序列。我們得到的抗體重鏈可變區(qū)VH基因共編碼113個氨基酸,序列中無停頓暗碼子,為一開放讀框;具有4個FR,3個DR和維持抗體V區(qū)空間布局所必須的2個特性性的半胱氨酸,別離位于第22位和第96位,為VDJ重排,切合小鼠IgGVH基因特性。同源性闡發(fā)表白,我們所得到的VH基因與GenBank中序列號為13832.1(Identities96%)和U88672.1(Identities93%)序列相似性較高,它們均為小鼠重鏈可變區(qū)基因。緩慢愛德華菌抗奇特型Ab重鏈可變區(qū)VH基因的樂成得到,為制備新型、有用的緩慢愛德華菌抗奇特型基因工程抗體奠基了基

9、矗參考文獻:1AandiA,HiuSF,RhveJS,etal.IslatinandharaterizatinfEdardsiellatardafrfallhinksaln(nrhynhustshaytsha)J.ApplEnvirnrbil,1982,43:1380-1384.2hiteFH,SipsnF,illiasLEJr.IslatinfEdardsiellatardafraquatianialspeiesandsurfaeatersinFlridaJ.JildlDis,1973,9:204-208.3HltJG,KriegNR,SneathPHA,etal.Bergeysanualfdeterinativebaterilgy.(NinthEditin),Baltire,illiasandilkins,1994:190-194,253-274.4張曉君,戰(zhàn)文斌,陳翠珍,等.牙鲆癡鈍愛德華菌熏染癥及其病原的研究J.水生生物學報,2022,291:31-37.5AkiT,EguasS,atanbeT.De