基因診斷課件

1、基因診斷Gene Diagnosis 疾病的根本原因: 疾病的各種表型的改變 是基因的改變造成的基因診斷: 采用分子生物學的技術方法來分析受檢者的某一特定基因的結構(DNA水平)或功能(RNA水平)是否異常，以此來對相應的疾病進行診斷。是病因的診斷。 檢查基因的存在、缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程?；蛟\斷(Gene Diagnosis)的含義基因診斷的原理1、基因診斷的原理：DNA診斷-檢測相關基因的結構及其表達功能是否正常。RNA診斷-對表達產(chǎn)物mRNA質和量表 達的分析。第一節(jié) 基因診斷的技術方法一、基因診斷中常用的分子生物學技術 核酸分子雜交 PCR SSCP（P

2、CR-SSCP） 限制酶酶譜分析 DNA序列測定 DNA芯片技術 核酸分子雜交：按照堿基互補配對原則，將不同來源的序列互補單鏈的DNA/DNA，RNA/RNA，互補配對成雙鏈雜交分子，這一過程叫核酸分子雜交。 一、原位分子雜交技術 DNA變性: 當溶液中的DNA分子處于高溫或高pH值(13)條件下, 維持雙螺旋在一起的堿基互補對就被破壞,DNA雙鏈解離 成兩條單鏈,這一過程叫DNA變性。 DNA復性: 當溫度降低至合適溫度或恢復pH值至中性，兩條裂 解的單鏈按堿基互補配對原則重新形成雙鏈結構,這一 過程叫DNA復性,又叫DNA雜交。 原位雜交：用核苷酸探針對特殊的核苷酸順序在其原位進行 (in

3、 situ hybridization)雜交,叫原位雜交?？捎?于DNA、RNA定位研究。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡技術 (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。(不僅可以檢出特異的DNA片段，而且能進行定位和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等)（二）RNA印跡技術 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質定性定量及相互作用研究。 So

4、uthern 印跡雜交用于基因探測的基本過程 Southern印跡雜交常用于探測DNA的限制性內切酶圖譜。通過檢測某個體特定基因及旁側區(qū)域限制性內切酶圖譜的變化，可判斷是否發(fā)生了明顯的DNA突變。具體方法圖示如下：組織或細胞 含已知基因的重組質粒菌株 基因組DNA 質粒DNA 限制酶酶解及電泳分離 限制酶酶解及電泳分離回收含已知基因的DNA片段 轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜 標記的探針 預雜交雜交 洗膜 放射自顯影 圖 用Southern 印跡雜交方法進行基因診斷的基本步驟 三種印跡技術的比較分子雜交實驗目 錄放射自顯影照片目 錄核酸分子雜交制備樣品制備探針雜交檢測獲得滿意的高特異性雜交的關鍵是控

5、制好雜交條件和雜交后沖洗條件獲得滿意的高特異性雜交的關鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件。雜交雙鏈的穩(wěn)定程度主要由其Tm值（熔解溫度）決定。影響雜交雙鏈Tm值的因素包括以下幾個方面：1)雜交雙鏈的堿基組成。GC含量越高，Tm越高。2)雜交雙鏈的長度。越長，Tm越高。3)雜交雙鏈的堿基錯配程度。錯配程度越低，Tm越高。4)溶液中的離子強度。離子強度越高，Tm越高。5)變性劑（如常用的甲酰胺）的影響。甲酰胺濃度越高，Tm越高。 在液相體系中，完全配對的核酸雙鏈的Tm值可以下列公式估計： DNA/DNA Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM 0.63甲酰胺(%) 60

6、0/LDNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.50甲酰 胺(%) 820/LRNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.35甲酰胺(%) 820/L寡聚核苷酸Tm(0C)2（AT堿基對數(shù)） 4（GC堿基對數(shù)） （適用于1030bp）Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM600/L （適用于1470bp）其中M為單價陽離子（通常為Na+）濃度, L為雜交雙鏈的長度，以堿基對計算。這些公式適用于0.010.4mol/L N

7、a+濃度及3075GC。 在無變性劑存在的條件下，最適雜交發(fā)生在比DNA/DNA Tm低20250C，比DNA/RNA Tm 低10150C。 在固液體系中，雜交條件對雜交雙鏈Tm值的影響更為復雜，一般低于按上述公式得到的計算值。(二) 聚合酶鏈式反應（ PCR polymerase chain reaction)又叫體外基因擴增技術。利用人工合成的一對引物，在被擴增DNA模板鏈的兩端形成雙鏈，由DNA聚合酶催化一對引物之間的聚合反應。 具體過程： 變性：將雙鏈DNA加熱（95）使之變性，DNA雙鏈 變成單鏈 退火：降低溫度至56使引物與模板DNA單鏈結合 延伸：將溫度升至72，在DNA聚合酶

8、作用下，在引 物3端進行延伸，使原模板DNA的一條鏈變成 兩條鏈。5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55（1）、基本工作原理目 錄Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目 錄模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ （2）、PCR體系基本組成成分（3）、PCR的基本反應步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C（三）、單鏈構象多態(tài)性(SSCP) 分析PCR和單鏈構象多態(tài)性(single stranded co

9、nformation polymorphism, SSCP) 分析 把 PCR后獲得的雙股DNA加熱變性后形成單鏈DNA，相同長度的DNA單鏈由于堿基順序不同，它們在中性聚丙烯酰胺凝膠中可有不同的構象而導致電泳速度的不同，這種現(xiàn)象稱為單鏈構象多態(tài)性。 PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)由SSCP分析，可能有效的檢出DNA順序變異。不是所有的核苷酸序列改變都引起可檢測的單鏈構象改變，因此SSCP方法并不能鑒別所有的突變。PCR/單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，可分析確定致病基因的存在。 四、限制酶酶譜分析基因突變導致酶切位點的丟失或相對位置

10、發(fā)生改變 以此酶消化待測DNA和野生型對照DNA，通過比較二者的酶切片段，的長度，數(shù)量上的差異就可判斷待測DNA的突變情況。 DNA序列測定 是進行基因突變檢測的最直接、最準確的方法。不僅可確定突變的部位，而且可確定突變的性質。 分子克隆到T載體上，或直接對擴增產(chǎn)物進行測序。 DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。（六） DNA芯片技術基因芯片(gene chip)目 錄二、基因診斷的基本方法基因變異致病的類型：內源基因的變異基因結構的突變點突變、插入、缺失、重排、異位、基

11、因擴增，基因表達異常mRNA剪接異常外源基因的插入基因突變的診斷點突變的診斷診斷已知的點突變 （PCR/ASO） ASO allele specific oligonucleotide等位基因特異性寡核苷酸探針突變堿基置探針中央控制雜交條件 結果分析：A TC G 探針定位 正常 C T (純合子) C T C G C A(雜合子) （新突變） （新突變）診斷未知的突變 PCR/SSCP/測序DNA芯片技術（大規(guī)模未知突變的篩查）N 4n1.28平方cm 16000個寡核苷酸 2 .大片段丟失或插入的診斷外側確定有無缺失及缺失片斷的相對大小內側確定缺失部位.多態(tài)性連鎖分析DNA多態(tài)性在同種生物

12、不同個體的基因組中，常存在一些不影響基因功能的DNA順序變異，稱為DNA多態(tài)性（polymorphism）DNA多態(tài)性標記限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)短串聯(lián)重復序列（short tandom repeat, STR）單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA酶切Southern雜交分析DNAPCR 酶切電泳分析由串聯(lián)重復順序導致的長度多態(tài)性STR含有較高的信息量且容易檢測STR由26個核苷酸串聯(lián)重復組成，微衛(wèi)星DNA基因表達

13、異常的診斷mRNA的相對定量分析斑點雜交RTPCRmRNA的絕對定量分析RTPCR/競爭性PCR(50bp標準cDNA已知濃度)mRNA長度分析Northern雜交/ RTPCR產(chǎn)物電泳 外源DNA檢測 核酸分子雜交 PCR技術 許多病原體的基因結構已被闡明，設計基因特異性探針，或合成特異的寡核苷酸引物，可直接從臨床標本中檢測病原體基因組核酸(DNA或RNA)的存在，即可早期、快速、敏感、特異地確定病原體的存在。第二節(jié) 基因診斷的應用1、遺傳疾病2、感染性疾?。?）病毒性感染（2）細菌性感染（3）寄生蟲（4）其他3、惡性腫瘤4、法醫(yī)學中的應用（1）DNA指紋分析（DNA fingerprint

14、ing）（2）短串聯(lián)重復多態(tài)性分析（short tandem repeat，STR）一、遺傳性疾病 Hb D Punjab血紅蛋白病 121位co密碼子由GAA突變位CAA，該突變導致限制酶EcoR1位點消失（GAATTC） 鐮刀型紅細胞貧血癥： 第六位密碼由GAG突變成GTG,導致不能被OxaN1酶切Mst酶切位點(GCTNAGG)53正?；?3突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析OxaN1+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析 遺傳性疾病-DMD的分子診斷杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchene mus

15、cular dystrophy,DMD）X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病,發(fā)病率為1/3 500個男孩，是 一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色 體連鎖的遺 傳性疾病。DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2400Kb DMD基因的突變導致抗肌萎縮蛋白dystrophin缺陷DMD基因外顯子缺失的檢測二、感染性疾病基因診斷的策略針對病原體特異的核酸序列設計探針進行雜交應用PCR技術擴增病原體基因保守序列核酸雜交技術與PCR技術聯(lián)合應用SARS相關冠狀病毒的分子診斷 2019年4月，香港研究者Peiris等報 告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和 病毒學研究結果證明，新冠狀病毒 可能是SARS

16、的致病原因。 （Lancet, 2019, 361: 9365) 其它實驗室陸續(xù)得出相同結論。 2019年4月，德國漢堡Bernhard- Nocht熱帶醫(yī)學研究所學者 Drosten 等用隨機擴增技術，獲得長度為 300 bp的核苷酸序列。 根據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀 病毒的常規(guī)和實時定量PCR技術。（ on April 10, 2019）引物和探針 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-1片段的內套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(熒光素標記的探針） 產(chǎn)物長

17、度：77 bp 檢測標本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺 泡灌洗液 、血漿、糞便。 檢測方法 逆轉錄-巢式PCR 討 論 疾病的早期即可獲得陽性結果（早 于血清轉換期）。 特異性較高（SARS患者中的陽性 率約為80%，對照中的陰性率約為 98%100%）。 現(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結果 不能排除病毒感染。討 論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道 排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒 復制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞 便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液， 提示不適合作為標本（有可能漏檢）。三、腫瘤

18、的基因診斷 腫瘤是由于遺傳物質（腫瘤相關 基因）發(fā)生突變而導致的疾病。 腫瘤相關基因的突變只是增加了 個體對腫瘤的易感性而并不一定 馬上產(chǎn)生腫瘤， 腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟 的過程。生物芯片技術在今后的腫瘤發(fā)病機制研究和腫瘤的診斷等方面將發(fā)揮越來越顯著的作用檢測腫瘤相關基因癌基因、抑癌基因、腫瘤轉移基因檢測腫瘤相關病毒的基因鼻咽癌EB，宮頸癌HPV檢測腫瘤標志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP）結腸癌癌胚抗原（CEA）ras癌基因的檢測ras基因中最常見的點突變是第12，13或61密碼子突變檢測方法：PCR/ASOPCR-SSCP p53的檢測p53基因突變主要為點突變，熱點區(qū)域位于密碼子130290，其中175、273、284密碼子突變最常見。檢測方法：PCRSSCPPCR測序PCRRFLPTotal RN