免疫組化總結(jié)

1、免疫組化總結(jié) 免疫組化定義 用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)( immunohistochemistry )技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)( immunocytochemistry )技 術(shù)。原理免疫組織化學(xué)染色方法的原理抗原(antigen)定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)(抗體和效應(yīng)細(xì)胞)在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能：( 1)免疫原性( immunogenicity )指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。(2)反應(yīng)原性(re

2、actogenicity)指抗原分子與抗體或效應(yīng) T細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn) 物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性?？乖姆诸?完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類胸腺依賴抗原與非依賴抗原外源性抗原：微生物、花粉等內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫瘤相關(guān)抗原等臨床分類同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物等之間存在的共同抗原抗體( antibody)定義：機(jī)體受到抗原刺激后，通過(guò)體液免疫應(yīng)答， B 淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱為抗體。大部分抗體電泳后位于丫區(qū)帶， 1972年國(guó)際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為

3、免疫球蛋白(immunoglobin ， Ig)。白體的種類:五類，即 IgA 、 IgD、 IgE、 IgG、 IgM 。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是IgG,個(gè)別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。通過(guò)對(duì)針對(duì)標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)色劑或酶類，再通過(guò)激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色以確定所要檢測(cè)的抗原是否存在。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測(cè)到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。免疫組織化學(xué)染色的顯色原理1）基本原理熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染

4、色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。直接法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測(cè)的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示出所檢測(cè)的目的抗原的部位。間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。間接法中所用的一抗是針對(duì)組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體，單克隆抗體是由小鼠制備的。第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來(lái)自同一種屬動(dòng)物，同標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來(lái)顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。通過(guò)某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度

5、。 IHC 技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。2）顯色的基本程序一抗孵育切片或細(xì)胞涂片二抗（酶標(biāo)抗體）孵育切片發(fā)色劑顯色（核復(fù)染）3）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑辣根過(guò)氧化物酶（ horseradish peroxidase ， HRP ）HRP + H2O2 HRP - H2O2HRP - H2O2+ DH2HRP + D + 2H2OHRP 催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應(yīng)的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如：CN （4-chloro-1-naphthol）為藍(lán)色TMB （tetramethyl-benzidine）為深藍(lán)色AEC (3-am

6、ino-9-ethyl-carbazoie)為紅色DAB (3, 3-diamino benzidine)為棕色堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是以AS-Mx為底物，F(xiàn)B/FR (Fast blue/Fast red)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色/紅色不容性沉淀物。ALP 標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC 染色。由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP ，在顯色液中需加入終濃度為 2-4mol/L 的左旋咪唑(levamisole) ，大多數(shù)內(nèi)源性ALP 活性可被抑制。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD )是以葡萄糖為底物的

7、酶， 其顯色方法為B -D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、 PMS (phenazinemethyl-sulfate ) 0.167mg 、 0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml ， 37 孵育 1 小時(shí)，生成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長(zhǎng)期保存。4)核復(fù)染在顯色后，特別是用 DAB 顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)行核復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的 DAB 棕色形成對(duì)比。但用 AEC 顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，因?yàn)榕渲铺K木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC 的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC 顯色后只能用水溶性封固劑封片。

8、石蠟切片的免疫組化主要步驟洗載玻片：將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4 混合液中，目的是為了是載玻片上的硅膠等除去，同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整，便于組織吸附，然后置于清水中清洗，除去殘余的重銘酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個(gè)小時(shí)左右 )，再將載玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于 Lys 帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。包埋組織：先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。切片：將包埋好的組織從模具上取

9、下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為 5um, 如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40溫水中。撈組織：當(dāng)組織載玻片置于40溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開(kāi)，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每種組織撈 5-6 張，其中 23 張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致，以便觀察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上

10、，放入37溫箱中烘干。脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精 -100%酒精 -95%酒精-90%酒精 -80%酒精 -70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10 min ，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15min。抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入 3%H2O2浸泡10min,從而 除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉 H2O2,在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩 沖液，放入微波爐中蒸煮 3min (中火) ，一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位

11、點(diǎn)暴露出來(lái)。血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2 次，并將載玻片置于PBS中5min,洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血泣 使一些非 特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍( 900ulPBS: 100ul血清封閉液)。加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加 PBS。加完一抗后于 4冰箱中保存過(guò)夜。加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入 PBS中洗3次，每次5min,擦干組 織周圍的 PBS 后加上二抗，然后置于37溫箱中半小時(shí)。加SABC:將片子從溫箱中取出，放入 PBS中

12、洗3次，每次5min,擦干組 織周圍的PBS后加上SABC,然后置于37c溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍(990ul PBS: 10ul SABC)。SABC：鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidinbiotin complex ， SABC )法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法。加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入 PBS中洗3次，每次5min,擦干組織周圍的 PBS 后加上顯色劑。 （顯色劑的配置：在1ml 水中加 1 滴顯色劑 A ，搖勻，然后加1滴顯色劑B,搖勻，再加1滴顯色劑C,搖勻）A: DAB B: H2O2 C:磷酸緩沖液DAB:即：二

13、氨基聯(lián)苯胺（3, 3 -diaminobenzidine）是過(guò)氧化物酶（Peroxidase的生色底物，在過(guò)氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成淺棕色不溶性產(chǎn)物。復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織 3-5min 。脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精 -95%酒精-100%酒精-100%酒精 -二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2 min,最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置

14、于通風(fēng)柜中晾干。冰凍切片的免疫組化組織取出后于-80或 -20保存，進(jìn)行冰凍切片，切好的冰凍切片于-80或 -20保存。需要時(shí)取出室溫恢復(fù)5 分鐘，參照石蠟切片的染色繼續(xù)染色。通常冰凍切片組織是不需要固定的，所以不需要抗原修復(fù)。細(xì)胞的免疫組化（ 1）固定：在細(xì)胞玻片上種上細(xì)胞，或涂片，用 PBS 清洗，用冷甲醇、丙酮固定110 min,或含3-4%多聚甲醛pH 7.4的PBS室溫固定15分鐘，再用冷 PBS 沖洗樣品 2 次；（ 2）通透：若目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則通透是至關(guān)重要的一步。將樣品在含0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育 10 分鐘（目標(biāo)蛋白為膜蛋白時(shí)不適用，因

15、為 Triton X-100 對(duì)細(xì)胞膜有損壞作用） ， PBS 沖洗細(xì)胞 3*5 分鐘；（ 3）封閉及孵育：細(xì)胞在含1% BSA 的 PBST 中孵育 30 分鐘，去封閉液，用含 1% BSA 的 PBST 稀釋的一抗在濕盒中室溫孵育1 小時(shí)或4過(guò)夜；棄一抗，用 PBS 洗 3*5 分鐘，用含1% BSA 的 PBST 稀釋的二抗室溫孵育1 小時(shí)（避光） ；去二抗溶液，用 PBS 洗 3*5 分鐘；（4）復(fù)染：DAPI （染細(xì)胞核）孵育細(xì)胞1 分鐘， PBS 沖洗；（ 5）封固：在玻片上滴加一滴中性樹脂封片，變干后顯微鏡下觀察，于-20或 4避光保存（封閉好的切片于顯微鏡下觀察常會(huì)出現(xiàn)下述問(wèn)題

16、：無(wú)染色、高背景和非特異性染色，解決方法可見(jiàn)后續(xù)常見(jiàn)問(wèn)題解答部分） 。免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)標(biāo)本固定 ： 固定的目的是：防止標(biāo)本從玻片上脫落；除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin S液或mDF 液效果較好。脫水、石蠟包埋和制片 ： 脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。脫蠟和水化： 這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60度20 min,然后立即二甲苯1-3分別10 min （這個(gè)時(shí)間是

17、由二甲 苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當(dāng)天制好的切片一般先60度3-4 h。水化 用梯度乙醇（由高到低） 。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色?？乖迯?fù)： 由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（分為：中性的、高 pH的等） 。一般用微波修復(fù)中 6min*4 次，注意微波修復(fù)后自然冷卻 30min 左右直 至修復(fù)液的溫度達(dá)室溫。細(xì)胞通透：這主要是針對(duì)細(xì)胞免疫

18、組化而言， 目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用 Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（ 10um 厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑， 一般在 PBS 中加入后終濃度是0.05%即可，而前者終濃度是0.5%-1% 。石蠟切片 4um 左右可以不通透，因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)被切開(kāi)了。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素： 在傳

19、統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD 一般 3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以 10 min 左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般 1030 min；用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或 PBS 可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4 度避光保存。血清封閉： 組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA 、羊血清

20、等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫 10-30min,但也要防止封閉過(guò)度。一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間： 一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種： 4 度、室溫、 37 度，其中 4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37 度 1-2h， 而 4 度過(guò)夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min 。 具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37 度 30min-1h ，具體時(shí)間需要摸索， 而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4 度最佳，反應(yīng)溫和，但時(shí)

21、間最好超過(guò) 1624h?？贵w稀釋液： 其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS 即可，但專用的抗體稀釋液中除 PBS 成份外， 還加了疊氮化鈉防腐劑、 BSA 穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。建議用專用抗體稀釋液，但是使用前需要鑒定稀釋的 pH 等，應(yīng)與抗體相匹配。切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗） ： 為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：?jiǎn)为?dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。建議用浸 洗方式；沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的

22、物質(zhì)。注意PBS的pH和離子強(qiáng)度的使用和要求，建議pH 在 7.4-7.6 濃度是 0.01M 。 （中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由 DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色 較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出 現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要 下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；止匕外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深， 還有

23、可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò) 低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗 4度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素 復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗 原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋 白則要短。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返 蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸

24、酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作 要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。封片：為了長(zhǎng)期保存，一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在 載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角， 接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液 體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題石蠟切片和冰凍切片的比較？（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)橹谱魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤 片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片； 但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組

25、織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不 需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原 彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上 都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者 都可，那就都能做。（ 3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80 度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止RNA 降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？（

26、 1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免） 。（ 2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting ，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（ 3）種屬反應(yīng)性的選擇

27、（species reactivity ） 。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。（ 4）種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克??；而小鼠來(lái)源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來(lái)源來(lái)選擇相應(yīng)的二抗。（ 5）生產(chǎn)廠家的選擇。不同廠商的抗體有專門的應(yīng)用領(lǐng)域，可以查看該產(chǎn)品引用文獻(xiàn)的情況來(lái)判斷。免疫組化結(jié)果如何分析？（1）陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40X光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組36 張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。（ 2）灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j

28、 進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。（ 3）評(píng)分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03 分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色） 、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（ 14 分為 025%、2650%、 5175%、 76100%） ，最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。如何才能充分脫蠟？（ 1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題， 切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；（ 2）脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季

29、節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多， 3-5 分鐘就足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(zhǎng)， 10-20 分鐘或更長(zhǎng)。（ 3）當(dāng)天切的切片，燒烤2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對(duì)切片進(jìn)行加溫10-20 分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果或許更好?？傊?，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。如何最大限度地降低組織非特異性染色？（ 1）縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)

30、控制。這是最重要的一條。（ 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，有條件可以換用單克隆抗體。（ 3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織） ，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；（ 4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；（ 5）縮短DAB 孵育時(shí)間或降低DAB 濃度/過(guò)氧化氫濃度等；（ 6）適當(dāng)增加PBS 沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤為重要；（ 7）防止標(biāo)本染色過(guò)程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？（ 1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題，盡量選擇可靠的供應(yīng)商。（ 2）組織切的不好，切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（ 3）組織的問(wèn)題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。（ 4）沒(méi)烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。（ 5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。（ 6）修復(fù)的問(wèn)題：抗原修