FUNDC1 and mitophagy全文英翻漢

1、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過線粒體外膜蛋白FUNDC1介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬【摘要】越來越多的證據(jù)表明，功能失調(diào)的線粒體可以通過線粒體自噬被選擇性地移除。線粒體自噬功能的失調(diào)與神經(jīng)退行性疾病和代謝性疾病的發(fā)展方面是密切相關(guān)的。個(gè)別的線粒體是怎么被識(shí)別后清除的，并且這個(gè)過程是如何被調(diào)控的我們尚不清楚。我們?cè)谖恼轮兴f的FUNDC1,是一種不可缺少的線粒體外膜蛋白，是一種由缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬受體。FUNDC1通過與典型的LC3結(jié)合基序Y（18）xxL（21）與LC3相互作用，LC3相互作用區(qū)的突變削弱了FUNDC1與LC3的相互作用以及隨后的線粒體誘導(dǎo)。內(nèi)源性FUNDC1的敲低顯著阻止缺氧誘導(dǎo)的線粒體

2、，這可以被野生型FUNDC1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)，但不是LC3相互作用缺陷型FUNDC1突變體的逆轉(zhuǎn)。機(jī)理/機(jī)制的研究進(jìn)一步揭示了缺氧誘導(dǎo)FUNDC1脫磷酸化和增強(qiáng)其與LC3的選擇性線粒體相互作用。因此，我們的研究結(jié)果提供了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量控制的深入了解?！灸康?、結(jié)果與方法】注：方法為實(shí)驗(yàn)操作與圖結(jié)合【總目的】探究“自噬”選擇性去除功能障礙的線粒體的機(jī)制【各論】一.線粒體外膜蛋白FUNDC1誘導(dǎo)線粒體自噬目的：1.1確定線粒體外膜蛋白的潛在功能探究線粒體外膜蛋白是否和如何導(dǎo)致線粒體自噬。方法：11（a）將HeLa細(xì)胞勻漿并分級(jí)分離，然后用Percoll梯度離心。通過用FUNDC1和不同細(xì)胞器

3、標(biāo)記物例如線粒體蛋白（TIM23），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（鈣聯(lián)接蛋白）和高爾基蛋白（GM130）的western印跡分析梯度級(jí)分（b）將細(xì)胞固定,然后用FUNDC1抗體（綠色）免疫染色，并對(duì)線粒體蛋白細(xì)胞色素c（紅色）進(jìn)行復(fù)染色。比例尺，10口m。（c）用編碼FUNDC1-Myc和Mito-dsRed的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GFP-LC3（綠色）穩(wěn)定HeLa細(xì)胞24小時(shí)。然后將細(xì)胞固定，并用FUNDC1（紫色，抗Myc）免疫染色。比例尺，10“n。（d）用編碼的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP對(duì)照載體。將FUNDC1-Myc陽性細(xì)胞和載體對(duì)照細(xì)胞（均為GFP陽性）分選并

4、用抗VDAC1抗體（10nm金顆粒）進(jìn)行免疫金色電子顯微鏡檢查。藍(lán)色框（插圖）表示VDAC1-陽性線粒體。綠色和紅色框表示吞噬線粒體的自噬體。黑色箭頭顯示雙膜自噬體。比例尺，500nm。d）用編碼的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞FUNDC1-Myc和GFP以4：1的比率或Myc和GFP對(duì)照載體。將FUNDC1-Myc陽性細(xì)胞和載體對(duì)照細(xì)胞（均為GFP陽性）分選并用抗VDAC1抗體（10nm金顆粒）進(jìn)行免疫金色電子顯微鏡檢查。藍(lán)色框（插圖）表示VDAC1-陽性線粒體。綠色和紅色框表示吞噬線粒體的自噬體。黑色箭頭顯示雙膜自噬體。比例尺，500nm（e）HeLa細(xì)胞用編碼FUNDC1-Myc，GFP-LC3

5、的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h，水稻dsRed和青色熒光蛋白LAMP1。收集代表性活細(xì)胞Z-Stack圖像和三維重建示例。綠色和藍(lán)色箭頭表示線粒體碎片被LC3和LAMP1陽性自體溶酶體包圍。比例尺，10口m.（f）用編碼的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，F(xiàn)UNDC1-Myc指示的時(shí)間和線粒體（TIM23，TOM20，VDAC1），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（鈣聯(lián)接蛋白）和高爾基標(biāo)記（GM130）蛋白通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。（g）HeLa細(xì)胞用編碼FUNDC1-Myc的載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12小時(shí)，放入或不放入巴佛洛霉素A1（BFA）溶液中，然后是TIM23,TOM20或通過western印跡檢測(cè)LC3。（h）Mito-Cherry穩(wěn)定的HeLa

6、細(xì)胞用編碼FUNDCl-Myc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24小時(shí)或48小時(shí),（Fdcl）和GFP以4：1的比率或與Myc對(duì)照載體一起孵育48小時(shí)。通過共聚焦捕獲每個(gè)樣品的五個(gè)隨機(jī)挑取的區(qū)域z軸，并掃描GFP陽性細(xì)胞的總面積和體積，進(jìn)行線粒體計(jì)算和定量（平均值土s.e.m。；n=90個(gè)細(xì)胞來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）；*P0.01。未裁剪的圖像印跡如附圖所示。S6。結(jié)果：11異位表達(dá)的FUNDC1誘導(dǎo)綠色熒光蛋白（GFP）-LC3斑點(diǎn)的顯著增加，與線粒體的片段化密切相關(guān)。12如圖1d所示，在電子顯微鏡下用表達(dá)FUNDC1-Myc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，在雙膜自噬小泡中，通過抗VDAC1的免疫膠體（10nm）可以清楚地觀察到

7、被隔離的線粒體的積聚。自噬泡囊完全不存在空轉(zhuǎn)染的細(xì)胞向量。三維成像研究表明，如圖1e所示。片段化線粒體被封閉在GFP-LC3和LAMP1陽性自噬溶酶體中。有趣的是，F(xiàn)UNDC1誘導(dǎo)總線粒體蛋白由于巴佛洛霉素A1能夠增強(qiáng)LC3-II的水平，F(xiàn)UNDC1可誘導(dǎo)自噬通量的增加（圖1g）。如預(yù)期的，總的線粒體體積在FUNDC1表達(dá)后顯著降低（圖1h）。此外，F(xiàn)UNDC1能夠誘導(dǎo)在MCF7細(xì)胞和新鮮分離自小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的線粒體自噬（補(bǔ)充圖S2）。結(jié)論：FUNDC1是介導(dǎo)線粒體自噬，線粒體質(zhì)量控制的重要機(jī)制。二作為含有LIR基序的蛋白質(zhì)的FUNDC1是選擇性線粒體的受體目的：21探究FUNDC1

8、對(duì)線粒體的自噬的作用22嘗試了解分子機(jī)制其中FUNDC1介導(dǎo)有絲分裂2.3論證FUNDC1是否通過LIR與LC3相互作用方法：2.1共免疫沉淀檢查：（a,b）將來自細(xì)菌（a）或HeLa細(xì)胞裂解物（b）的純化的FUNDC1蛋白與固定的GST或GST-LC3B珠孵育，然后用FUNDC1抗體檢測(cè)FUNDC1。使用考馬斯染色觀察GST和GST-LC3B蛋白。（c,d）用GFP或GFP-LC3B轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，收集細(xì)胞用于用抗GFP或抗FUNDC1的免疫沉淀（IP），并分別用FUNDC1或GFP抗體分析。IB，免疫印跡。（e）FUNDC1與LC3家族蛋白相互作用。將來自HeLa細(xì)胞的細(xì)

9、胞提取物與固定的GST或所示的GST融合蛋白一起孵育。免疫沉淀FUNDC1用FUNDC1抗體檢測(cè)。使用PonceauS染色來顯現(xiàn)GST和GST-融合蛋白。引發(fā)一系列突變，例如Y18A，L21A，Y18A/L21A雙突變體和來自氨基的缺失突變體酸18至21，在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)這些突變體。（f）典型的LIR序列與FUNDC1一起手工比對(duì)用于比較。陰影區(qū)域表示FUNDC1的推定LIR中的高度保守殘基。（g）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒或指定的突變體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，裂解細(xì)胞與固定的GST-LC3B溫育。通過用Myc抗體的western印跡檢測(cè)共沉淀的蛋白質(zhì)。使用PonceauS

10、染色來顯現(xiàn)GST-融合蛋白。（h）在顯示Y18evL21的LIR的線粒體外膜中的FUNDC1蛋白的示意圖。2.3（i）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)?；蛑付ǖ耐蛔凅w（紫色，抗Myc）和GFP-LC3共轉(zhuǎn)染FUNDC1-敲低的HeLa細(xì)胞24小時(shí)。與野生型FUNDC1相比，F(xiàn)UNDC1的LIR突變體具有削弱的誘導(dǎo)GFP-LC3點(diǎn)數(shù)目增加的能力。比例尺,10口m。（j）用ImageJ（平均值土s.e.m。；來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=90個(gè)細(xì)胞）定量用Myc載體或編碼野生型或LIR-突變體FUNDC1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)的數(shù)量。（k）Western印跡檢測(cè)由Myc載體和野生型和LIR突變體

11、FUNDC1誘導(dǎo)的LC3-II的變化。印跡的未裁剪圖像顯示在補(bǔ)充圖。S6。結(jié)果：2.1FUNDC1確實(shí)與LC3B（圖2a-d）和其他LC3同源物進(jìn)行了物理性的相互作用（圖2e）。2.2自噬受體如p62和Atg32與LC3及其同源物，通過具有核心共有序列的典型的線性基序序列W/YxxL/I結(jié)合（圖2f）；表明FUNDC1和LC3之間的相互作用是通過LIR區(qū)域（圖2g）；表明FUNDC1是一個(gè)線粒體外膜蛋白，通過其在細(xì)胞溶膠暴露N端的LIR與LC3相互作用（圖2h）2.3數(shù)據(jù)表明FUNDC1誘導(dǎo)的線粒體自噬高度依賴于它與LC3的相互作用三內(nèi)源性FUNDC1在線粒體中的生物學(xué)意義目的：了解內(nèi)源性FU

12、NDC1在線粒體中的生物學(xué)意義方法：.（a）FUNDC1-敲低HeLa細(xì)胞與Myc載體和編碼FUNDC1-Myc，F(xiàn)UNDC1118-21，F(xiàn)UNDC1W32-33A（SEQIDNO：藍(lán)色，抗Myc）和GFP-LC3孵育24小時(shí)。如圖1的標(biāo)題中所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖像顯示LIR結(jié)構(gòu)域缺失突變體而不是W32-33A突變體不能誘導(dǎo)GFP-LC3點(diǎn)數(shù)目的增加，盡管它誘導(dǎo)線粒體片段化。比例尺，10口m。定量含有斷裂線粒體的細(xì)胞數(shù)（平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差n=來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的100個(gè)細(xì)胞）。（b）用Myc載體和編碼FUNDC1-Myc和FUNDC1118-21的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染FUNDC1-敲低的HeLa細(xì)胞。24小時(shí)后

13、，處理細(xì)胞并通過電子顯微鏡分析（黑色箭頭，自噬空泡）。比例尺，600nm（c）轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞和ATG5敲低（ATG5KD）細(xì)胞中LC3和TIM23表達(dá)的Western印跡分析編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒12和24小時(shí)。（d）使用共聚焦顯微鏡觀察在用編碼FUNDC1（紅色，抗Myc）和GFP-LC3（綠色）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照和ATG5敲低細(xì)胞中的自噬體的出現(xiàn)24小時(shí)。比例尺，10口m。定量自噬細(xì)胞的數(shù)量（平均值土s.e.m。；來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=100個(gè)細(xì)胞）。（e）對(duì)照細(xì)胞和BECN1敲低細(xì)胞中LC3和TIM23表達(dá)的Western印跡分析用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12和24小時(shí)。

14、（f）共聚焦顯微鏡用于顯示在用編碼FUNDC1（紅色，抗Myc）和GFP-LC3（綠色）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照和BECN1敲低細(xì)胞中24小時(shí)的自噬體的出現(xiàn)。印跡的未裁剪圖像顯示在補(bǔ)充圖。S6。結(jié)果：FUNDC1誘導(dǎo)線粒體依賴于ATG5，因?yàn)锳TG5的敲低HeLa細(xì)胞完全阻斷GFP-LC3斑點(diǎn)的形成LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化和TIM23的減少，誘導(dǎo)的FUNDC1（圖3c,d）。然而，BECN1的敲低不能預(yù)防FUNDC1誘導(dǎo)的mitophagy（圖3e，f）。結(jié)論：數(shù)據(jù)表明FUNDC1通過相互作用介導(dǎo)選擇性的線粒體LC3通過LIR與核心自噬機(jī)制耦合四.FUNDC1介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的mitophagy目的

15、：4.1進(jìn)一步明確FUNDC1在線粒體中的作用4.2進(jìn)一步證明FUNDC1是缺氧誘導(dǎo)的mitophagy的特異性調(diào)節(jié)劑方法：4.1（a）將HeLa細(xì)胞暴露于缺氧條件指定的時(shí)間。TIM23，細(xì)胞色素c，鈣聯(lián)接蛋白和LC3蛋白通過蛋白質(zhì)印跡分析。（b）在存在或不存在巴佛洛霉素A1（BFA）的情況下，HeLa細(xì)胞用缺氧處理0和12小時(shí);TIM23，TOM20,FUNDC1和LC3。（c）GFP-LC3穩(wěn)定HeLa細(xì)胞維持在缺氧條件下24小時(shí)。然后用抗VDAC1抗體（5nm金顆粒）處理樣品用于標(biāo)記線粒體（箭頭）和抗GFP抗體（10nm金顆粒）以標(biāo)記自噬體（箭頭）的免疫金色電子顯微鏡。比例尺，300nm

16、。（d）對(duì)照和FUNDC1敲低（KD）HeLa細(xì)胞用1%02處理0或18小時(shí)，并通過用不同抗體的western印跡分析。4.2在FUNDC1所在的細(xì)胞中進(jìn)行的救援實(shí)驗(yàn)：（e）對(duì)照HeLa細(xì)胞和FUNDC1敲低穩(wěn)定HeLa細(xì)胞維持在缺氧條件下24小時(shí)或?qū)φ誋eLa細(xì)胞在常氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)。通過電子顯微鏡分析樣品。棒，500nm。（f）對(duì)照HeLa細(xì)胞和FUNDC1敲低的穩(wěn)定HeLa細(xì)胞在常氧下生長(zhǎng)或暴露于1O224小時(shí)。細(xì)胞用TIM23染色。通過共聚焦z軸掃描捕獲每個(gè)樣品的三個(gè)隨機(jī)挑取的區(qū)域，并且定量線粒體的總面積和體積（平均值土s.e.m。;來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=90個(gè)細(xì)胞）。*P0.01

17、。（g）FUNDC1敲低細(xì)胞用FUNDC1或FUNDC1突變體轉(zhuǎn)染24小時(shí)，然后暴露于低氧條件另外24小時(shí)。收集樣品用于western印跡。（h）對(duì)照和FUNDC1敲低細(xì)胞暴露于1O224小時(shí)。線粒體被細(xì)胞色素c抗體染色。計(jì)算片段化線粒體的百分比（平均值土s.e.m。；來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=100個(gè)細(xì)胞）。*P0.01。（i）對(duì)照和FUNDC1敲低細(xì)胞用GFP-LC3轉(zhuǎn)染24小時(shí)，然后暴露于1O20或24小時(shí)。定量每個(gè)細(xì)胞的GFP-LC3點(diǎn)的數(shù)目（平均值土s.e.m。；來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=100個(gè)細(xì)胞）。NS,無顯著性。印跡的未裁剪圖像顯示在補(bǔ)充圖。S6。結(jié)果：4.1生化分析顯示線粒體蛋白T

18、IM23和細(xì)胞色素的水平c在缺氧處理中以時(shí)間依賴性的方式降低，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白鈣聯(lián)接蛋白不受影響（圖4a）。低氧誘導(dǎo)的線粒體蛋白如TIM23，TOM20和FUNDC1的降解可以被巴弗洛霉素A1抑制（圖4b）。GFP-LC3（10nm免疫膠質(zhì)）-陽性，通過電子顯微鏡分析可以清楚地觀察到含有由VDAC1（5nm免疫膠質(zhì)）標(biāo)記的線粒體的雙膜自噬體（圖1,4c）。最重要的是，線粒體蛋白的降解可以通過Western印跡分析顯示的FUNDC1的敲低（圖4d）。4.2擊倒FUNDC1導(dǎo)致線粒體完整性的顯著保護(hù)（圖4h），而不影響一般自噬如在缺氧處理的細(xì)胞中LC3-II的轉(zhuǎn)化和GFP-LC3斑點(diǎn)的總數(shù)所示（圖4d

19、，i）。敲除FUNDC1對(duì)饑餓誘導(dǎo)的LC3轉(zhuǎn)化或TIM23和TOM20蛋白的減少?zèng)]有影響（補(bǔ)充圖S3a-c）。結(jié)論：在缺氧條件下，F(xiàn)UNDC1介導(dǎo)高選擇性線粒體清除率不影響一般自噬。五.FUNDC1的去磷酸化激活缺氧誘導(dǎo)的線粒體目的：如何調(diào)節(jié)FUNDC1和LC3之間的相互作用以響應(yīng)缺氧。方法：（a）如通過抗-p-FUNDC1（Tyr18）和抗-p-Src（Tyr416）抗體所指示的,FUNDC1和Src激酶在缺氧條件下脫磷酸化的時(shí)間過程。（b）用編碼FUNDC1-Myc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染編碼GFP,Src-GFP或Src（mt）-GFP（激酶死亡）的質(zhì)粒，并通過抗Myc抗體免疫沉淀（IP）樣品，并用

20、抗磷酸酪氨酸抗體。（c）在Src-GFP或GFP存在下，用編碼Myc，F(xiàn)UNDC1-Myc和突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。用抗Myc抗體免疫沉淀裂解物并用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。（d）體外激酶測(cè)定：將GST，GST-FUNDC1或GST-FUNDC1Y18W與或不與Src孵育20分鐘，然后通過western印跡分析樣品。（e）Cherry-LC3陽性FUNDC1敲低細(xì)胞用編碼FUNDC1或FUNDC1Y18W的質(zhì)粒在Src-GFP或GFP存在下共轉(zhuǎn)染24小時(shí)。顯示了代表性的共焦顯微鏡圖像。比例尺，20口m。（f）自噬體（AV）的總面積被定量（平均值土s.e.m。；來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的n=200個(gè)細(xì)

21、胞）。*P0.01。NS，無顯著性。（g）用編碼GFP或Src-GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞維持在缺氧條件下或在常氧條件下保持12小時(shí)。通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞。（h）將FUNDC1-Myc轉(zhuǎn)染體裂解物與固定的GST或GST-LC3B珠孵育，并通過western印跡檢測(cè)。使用PonceauS顯現(xiàn)GST和GST-LC3B。（i）將HeLa細(xì)胞暴露于含氧量正?；蛉毖鯒l件下24小時(shí)。內(nèi)源性LC3用抗FUNDC1抗體或IgG免疫沉淀。通過western印跡分析樣品。（j）HeLa細(xì)胞用缺氧或常氧處理。通過用抗LC3（紅色）和抗FUNDC1（綠色）抗體的免疫熒光顯現(xiàn)樣品。比例尺,20口m。（k）FUND

22、C1在缺氧反應(yīng)的線粒體中的假設(shè)模型。FUNDC1在Tyr18在含氧量正常的Src酪氨酸激酶磷酸化，并在缺氧條件下脫磷酸化。這增加其與LC3-II的結(jié)合，其在缺氧處理下大量產(chǎn)生。LC3結(jié)合的隔離膜的募集將導(dǎo)致線粒體周圍的隔離膜的擴(kuò)展以形成自噬體，其然后與溶酶體融合降解。印跡的未裁剪圖像顯示在補(bǔ)充圖。S6。結(jié)果：4.1計(jì)算分析預(yù)測(cè)，Src激酶可能負(fù)責(zé)FUNDC1的Tyr18磷酸化（參考文獻(xiàn)29,30）。FUNDC1的孵育其突變Y18W與Src激酶進(jìn)一步證明FUNDC1是Src激酶的直接底物（圖5d）。此外，Src激酶抑制FUNDC1介導(dǎo)的線粒體反應(yīng)缺氧（圖5g）。這些數(shù)據(jù)表明FUNDC1的去磷酸化

23、觸發(fā)了線粒體的激活響應(yīng)缺氧。FUNDC1是選擇性的受體通過其特征性LIR來應(yīng)答缺氧的線粒體特異性地與LC3相互作用。在正常生理?xiàng)l件下，F(xiàn)UNDC1介導(dǎo)的mitophagy被其磷酸化抑制在Src激酶的LIR基序的Tyr18位置。關(guān)于缺氧刺激，已發(fā)現(xiàn)FUNDC1是如何作為一個(gè)mitophagy受體與核自噬機(jī)制耦合（文獻(xiàn)：34）。以前的研究表明Atg32通過其LIR主題與Atg8高度相互作用在酵母中的特異性mitophagy19,20,Atg32和FUNDC1在有絲分裂期間減少（圖5和S4b，c）。線粒體碎裂是一個(gè)先決條件，但不足以用于自噬體形成。敲低FUNDC1減少LC3的募集線粒體和預(yù)防線粒體碎

24、片缺氧，可降低線粒體的水平。FUNDC1是保守的在高等真核生物中并在大多數(shù)組織中高度表達(dá)（補(bǔ)充圖S4a），表明有絲分裂的機(jī)制對(duì)于細(xì)胞功能是重要的。Nix參與缺氧誘導(dǎo)的自噬并且是不可缺少的用于在網(wǎng)織紅細(xì)胞期間程序性消除線粒體成熟（文獻(xiàn)：15,27,36）。顯然，F(xiàn)UNDC1誘導(dǎo)的機(jī)制線粒體與Nix或其同源物BNIP3的不同。另外，盡管發(fā)現(xiàn)兩者都是參與由缺氧誘導(dǎo)的線粒體誘導(dǎo)，增加的表達(dá)觀察到Nix或BNIP3，而FUNDC1的水平降低。此外，Nix和BNIP3定位在其他細(xì)胞器，參與調(diào)節(jié)凋亡或程序性壞死影響線粒體呼吸27,39,40。顯然，F(xiàn)UNDC1不影響FUNDC1后缺氧條件下的細(xì)胞活力擊倒（補(bǔ)

25、充圖S5b-d）。結(jié)論：總的來說，F(xiàn)UNDC1和BNIP3在誘導(dǎo)有絲分裂中的角色是不同的，雖然我們不能排除他們用于線粒體有合作的可能性。六.一般方法方法動(dòng)物：基于由InstitutionalAnimalCareCommittee批準(zhǔn)的動(dòng)物方案維持和護(hù)理所有小鼠。將成年C57BL/6（B6）小鼠在缺氧室中在含氧量正?；?%缺氧條件下處理72小時(shí)，然后制備腦組織，并通過western印跡檢測(cè)線粒體蛋白如TIM23，F(xiàn)IS1，MFN1和FUNDC1?？贵w：抗TIM23（1:1,000），抗TOM201:1000（BDBiosciences），抗GFP（1:2000，單克隆;SantaCruz），抗細(xì)

26、胞色素c（1:1000），抗鈣粘蛋白-1（1：1,000），抗鈣聯(lián)蛋白單克隆抗體（1：1,000），抗GM130單克隆抗體（1：1,000;BDBiosciences）;抗LC3B多克隆抗體（1:1000），抗肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（1:10,000;Sigma）;抗c-Myc單克隆抗體（1：1,000;SantaCruz）;抗FUNDC1多克隆抗體(1：1,000;AVIVA);抗GFP多克隆抗體(1:2,000;Invitrogen);抗VDAC1單克隆抗體(1:2000)，抗Bnip3多克隆抗體(1:1000;Abeam);抗Src(1：1,000)和抗Sre(Tyr416)多克隆抗體(1：

27、1,000;CellSignaling);抗GST(1:3,000);通過用純化的磷酸肽在FUNDC1中免疫兔并親和純化(Abgent)產(chǎn)生抗P-FUNDC1(Tyr18)多克隆抗體(1：1,000)。使用以下熒光二抗：山羊抗小鼠IgG異硫氰酸熒光素(FITC)，Cy3(DAKO);山羊抗兔IgG(DAKO);山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)。通過使用pET28a表達(dá)載體在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組FUNDC1(6跨膜結(jié)構(gòu)域)蛋白免疫兔產(chǎn)生針對(duì)FUNDC1的多克隆抗體。對(duì)于免疫沉淀測(cè)定，抗GFP多克隆抗體1:1000(Invitrogen)，抗FUNDC11:1000,抗Mye1:100;用

28、于免疫熒光，抗TIM231:100，抗TOM201:100，抗細(xì)胞色素e1:100，抗Mye1:100，抗FUNDC11:50，抗LC3B(納米工具)1:50。使用以下熒光二抗：山羊抗小鼠IgGFITC1：100;山羊抗小鼠IgGCy31:100;山羊抗兔IgGFITC(DAKO)1:100;山羊抗小鼠Cy5(Invitrogen)1:100。BafilomyeinA1和新霉素購自Sigmao免疫金抗體(1:50)購自Jackson實(shí)驗(yàn)室和Sigma。6.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HeLa細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清(Hyclone)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中在37C，5%CO2下生長(zhǎng)。用用1%0

29、2，5%CO2和95%N2的預(yù)分析氣體混合物沖洗的缺氧室(Billups-Rothenberg)實(shí)現(xiàn)缺氧條件。在FUNDC1中用于RNA干擾的靶序列是50-GCAGCACCTGAAATCAACA-30;ATG5中的靶序列為50-GAAGTTTGTCCTTCTGCTA-30;加擾RNA干擾序列為30-GACATTTGTAACGGGATTC-50;在用于RNA干擾的beelin-1中的靶序列是50-CTCAGGAGAGGAGCCATTT-30。根據(jù)制造商的說明書(Ambion)設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA的引物，并克隆到pSileneer2.1-neo載體中。為了建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，用相應(yīng)的載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞

30、并用新霉素選擇。6.4實(shí)時(shí)PCR分析：使用TRIzol試劑(Invitrogen)制備RNA。使用SuperSeriptVILOeDNA合成試劑盒(Invitrogen)合成互補(bǔ)DNA。通過使用QuantOneStepqRT-PCR(Probe)試劑盒(Tiangen)和CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。對(duì)于半定量PCR，(ATGGCATCCCGGAACCCCC-3050AGATGCCAGGCCTAGCAAAAAG-3050HPRTCACAGGACTAGAACACCTGC-3050-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-30（反向）。引物如下正

31、反正FUNDC150向向向?qū)τ趯?shí)時(shí)PCR引物如下:FUNDC150-GCAGTAGGTGGTGGCTTTC-30（正向）和50TGCTTTGTTCGCTCGTTT-30反向），50-GAPDHTGCACCACCAACTGCTTAGC-30（正向）和50-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-30（反向）。6.5細(xì)胞活力測(cè)定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶測(cè)定試劑盒(BDBioseienees)通過膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡事件。使用商業(yè)LDH測(cè)定試劑盒(JianchengBioengineering)根據(jù)制造商的說明書檢測(cè)LDH活性。6.6免疫熒光顯微鏡：細(xì)胞在蓋玻片

32、上生長(zhǎng)至60%匯合。處理后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并在37C下用新鮮制備的3.7%甲醛固定15分鐘。通過用0.2%TritonX-100處理增加抗原可及性。將細(xì)胞與第一抗體孵育1小時(shí)，并且在用PBS洗滌后，用第二抗體染色另外45分鐘。用LSM510Zeiss共聚焦顯微鏡捕獲細(xì)胞圖像。電子顯微鏡。如上所述培養(yǎng)和處理細(xì)胞。對(duì)于免疫電泳顯微術(shù)，首先將細(xì)胞用2%多聚甲醛和0.2%戊二醛在二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.4）中37C孵育2小時(shí)，然后脫水在分級(jí)乙醇系列中并嵌入丙烯酸樹脂（LRWhite）中。70nm超薄將切片安裝在鎳網(wǎng)上，用1%BSA/PBS孵育并孵育在4C下用1%BSA/PBS中的一抗（抗GF

33、P抗體（稀釋度1/200）和/或抗VDAC1抗體，終濃度為2ug/ml）的混合物過夜，洗滌5次，每次5min，然后在5%（或20nm）的山羊抗小鼠對(duì)于VDAC1和10nm山羊抗兔對(duì)于在1%BSA/PBS中的GFP-LC3金綴合的顆粒標(biāo)記2小時(shí)。最后在0.5%BSA/PBS中將網(wǎng)格洗滌4次，每次5分鐘，在1%戊二醛/PBS中孵育15分鐘，在PBS中洗滌2次，在蒸餾水中洗滌3次，在室溫下染色和干燥。使用120kVJeol電子顯微鏡在80kV下觀察樣品，并使用AMT數(shù)字照相機(jī)捕獲圖像。SDS和western印跡：在裂解中裂解細(xì)胞或膜級(jí)分緩沖液（20mMTris，pH7.4,2mMEGTA，1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。當(dāng)量蛋白質(zhì)量（20ug）進(jìn)行SDS，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用所示的一級(jí)抗體，隨后是合適的HRP綴合的二級(jí)抗體（KPL）探測(cè)膜。用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce）顯現(xiàn)免疫反應(yīng)條帶。免疫沉淀。使用鈣瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞磷酸鹽法。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞用0.5ml裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑（RocheAppliedScience）在冰上30分鐘。在12,000g離心15分鐘后，裂解物進(jìn)行免疫沉淀與特異性抗體和蛋白A-Sepharose（Invitrogen）在4過夜。然后，用裂解緩沖液洗滌沉淀物三次，免疫復(fù)合物用含有1%SDS的樣品緩沖液洗脫5分鐘在95C下