課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

1、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)課題背景1.尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2.細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)脲酶+ CO2NH3+ H2O研究思路1.篩選菌株在微生物學(xué)中，將允許特定微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇則培養(yǎng)基。研究思路2.統(tǒng)計菌落數(shù)目（1）顯微鏡直接計數(shù) 利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。（2）稀釋涂布平板法 在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由 一個單細(xì)胞繁殖而成的，即一個菌落代表原

2、先的一個單細(xì)胞。優(yōu)點：能準(zhǔn)確統(tǒng)計微生物的實際數(shù)目。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；研究思路P22實例：你認(rèn)為哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實值？你認(rèn)為這兩位同學(xué)的實驗需要改進(jìn)嗎？如果需要，如何改進(jìn)？第一位同學(xué)：沒有重復(fù)實驗（至少涂布3個平板）。第二位同學(xué)：A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值。研究思路稀釋涂布平板法計算注意事項為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計數(shù)。為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中， 經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。這是因為當(dāng)兩個或兩個細(xì)胞連 在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌 落數(shù)而不

3、是用活菌數(shù)來表示。研究思路3.設(shè)置對照P23實例：你能通過設(shè)置對照，幫助A同學(xué)排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素嗎？方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實驗 結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué) 存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照， 以證明培養(yǎng)基是否受到污染。小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。 設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高 實驗結(jié)果的可信度。實驗設(shè)計1.土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取

4、樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。注：取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。2.制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基實驗設(shè)計3.樣品的稀釋與涂布在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行；實驗設(shè)計注：在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。4.微生物的培養(yǎng)、觀察和計數(shù)實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。結(jié)果分析與評價結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。對照培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已經(jīng)篩選出一些菌落。課題延伸在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨。氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。因此，我們可以通過檢測培養(yǎng)基pH變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。本堂小結(jié)一、選擇培養(yǎng)基的成分 尿素作為唯一的氮源二、鑒定方法 在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，說明細(xì)菌能分解尿素。三、統(tǒng)計菌落數(shù)目的方法（1）顯微鏡直接計數(shù)法（2）間接計數(shù)法（稀釋涂布平板計數(shù)法）設(shè)置重復(fù)組，選擇菌