基因診斷和基因治療(3)

1、關(guān)于基因診斷與基因治療 (3)1第一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2本章討論二大方面內(nèi)容 基因診斷 基因治療第二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3 一. 基因診斷概念 ： 利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否異常，從而對疾病作出診斷的方法。第一節(jié) 基 因 診 斷第三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4二. 基因診斷特點(diǎn)： 針對性強(qiáng)，特異性高 檢測靈敏度和精確性高 實(shí)用性強(qiáng)，診斷范圍廣 第四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5三. 基因診斷常用技術(shù)方法 核酸分子雜交技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 生物芯片 基因測序第五

2、張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6（一）核酸分子雜交技術(shù) 核酸分子雜交 是指單鏈核酸分子（DNA或RNA）在特定條件下，與另一條互補(bǔ)的特異核酸鏈形成穩(wěn)定雙鏈的過程。 主要依據(jù)： 堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性 DNA與DNA雜交： A=T、 GC ; DNA與RNA雜交: A=U、 GC ; 變性： 在一定溫度下，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈； 復(fù)性： 隨溫度逐漸恢復(fù)，變性的兩條單鏈重新形成互補(bǔ)雙鏈堿基互補(bǔ)第六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月7 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G

3、 T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C第七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月8 利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對，以判斷有無互補(bǔ)的同源核酸序列的存在。 核酸探針 是指帶有標(biāo)記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補(bǔ)配對結(jié)合，進(jìn)而檢測同源序列。 探針標(biāo)記物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類。第八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9 1.核酸分子雜交的分類 液相雜交

4、： 待測核酸樣本與特異性探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)；固相雜交： 待測核酸樣本先結(jié)合到固相支持物上，再與溶液中的特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。 常用固相雜交支持物： 硝酸纖維素膜、尼龍膜等 第九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月102.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標(biāo)記核酸探針檢測雜交信號標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針第十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月11 3. 常用固相核酸雜交方法 Southern 印跡雜交法（Southern blotting ） Northern 印跡雜交法（Nort

5、hern blotting ） 斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交法 （Spot/ Slot blot hybridization） 菌落雜交（colony hybridization） 夾心雜交法（sanwich hybridization） 原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）第十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月12 (1) Southern 印跡雜交法 （Southern blotting ） 限制性內(nèi)切酶酶切 檢測雜交信號 提取DNA Southern 法可用于檢測特異的DNA序列片斷、基因定位、分子量測定等。第十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2

6、022年6月13（2）Northern 印跡雜交法 （Northern blotting ） （其基本過程類似于上述Southern法） 提取RNA樣本RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移至膜探針（標(biāo)記DNA或RNA）與之雜交顯影或顯色檢測信號。 Northern法可用于檢測組織細(xì)胞中總RNA或mRNA 第十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月14（3）斑點(diǎn)雜交或狹縫雜交法： 基本過程： 將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)到固相支持濾膜上用標(biāo)記探針與之雜交自顯影或顯色反應(yīng)檢測雜交信號分析結(jié)果。 優(yōu)點(diǎn)： 簡便、快速、靈敏、樣本用量少； 缺點(diǎn)： 特異性不高，有一定比例的假陽性。 第十四張，PPT共六

7、十二頁，創(chuàng)作于2022年6月15（4）菌落雜交（colony hybridization）該法可從大量細(xì)菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。第十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月16（5）夾心雜交法（sanwich hybridization）ABREREABAB固相支持物片段B捕捉探針 片斷A 檢測探針 本法優(yōu)點(diǎn)： 特異性強(qiáng)，對樣本純度要求不高，定量較準(zhǔn)確。第十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月17（6）原位雜交（nucleic acid hybridization in situ） 將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列。

8、細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNA-DNA RNA-DNA 三類雜交 RNA-RNA 該法優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。有第十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月18（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，polymerase chain reaction)技術(shù) PCR是體外基因擴(kuò)增技術(shù)。它利用體內(nèi)DNA復(fù)制的原理和DNA變性與復(fù)性的性質(zhì)進(jìn)行目的基因DNA的大量擴(kuò)增。 1. PCR基本原理： PCR技術(shù)在模板、dNTP、Mg2+等條件下，用耐熱的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合

9、（復(fù)性）和延伸3個(gè)步驟的循環(huán)過程（2530個(gè)循環(huán)），目的DNA可擴(kuò)增100萬倍以上。第十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月19（1）DNA模板的變性 將待擴(kuò)增DNA加熱到950C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈（即：使模板DNA或延伸后的雙鏈DNA發(fā)生熱變性 ），并游離于反應(yīng)體系中作為模板；（2）模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性） 將體系溫度降至合適溫度（550C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。（由于加入的引物量遠(yuǎn)多于模板量，所以引物與模板的結(jié)合比例遠(yuǎn)大于模板自身的復(fù)性）；第十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月20（3）引物延伸 將體系溫度升到720

10、C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA引物3端，使引物延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。 以上為一次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸） （新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板） 按照上述步驟重復(fù)操作，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。模板DNA 擴(kuò)增倍數(shù)T=2n (n: 循環(huán)次數(shù))。第二十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月21 PCR技術(shù)原理示意圖第二十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月22 2. PCR各要素及其作用（1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個(gè)拷貝； RNA作為模板時(shí)，需要： RNA cDNA PCR, 稱

11、此為RT-PCR. （2）耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是從耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在94變性 55退火71延伸循環(huán)30次過程中不變性失活。 在PCR中，Taq DNA聚合酶應(yīng)用最廣泛。 逆轉(zhuǎn)錄第二十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月23（3）引物 引物是根據(jù)已知序列的模板DNA待擴(kuò)增區(qū)兩端而設(shè)計(jì)的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個(gè)堿基。 引物是保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性的關(guān)鍵因素，其設(shè)計(jì)與合成對PCR的成功至關(guān)重要。 引物設(shè)計(jì)原則如下：第二十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月24 引物設(shè)計(jì)應(yīng)符合以下基

12、本原則： 長度適宜，一般為1530個(gè)堿基； G+C含量，一般為4060； 4種堿基應(yīng)隨機(jī)性分布； 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列； 兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)堿基的互補(bǔ)； 引物3端不應(yīng)有任何修飾； 引物5可以修飾。第二十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月25（4）緩沖溶液與Mg2+ PCR技術(shù)常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度 PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應(yīng)相等；第二十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月26（6）參數(shù) 變性溫度與時(shí)間 一般選擇： 940C，

13、30秒 退火溫度與時(shí)間 取決于引物長度、濃度 和G+C含量， 一般選擇： Tm - 5 延伸溫度與時(shí)間 一般選擇： 70 75循環(huán)次數(shù) 取決于模板濃度， 一般循環(huán)：30次第二十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月27 PCR操作 各種PCR反應(yīng)的操作基本相同，只是根據(jù) 引物與靶序列不同，選擇不同的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。 將PCR反應(yīng)管置于DNA自動(dòng)化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數(shù)，使DNA擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。 PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn) 特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)，對樣本質(zhì)量要求不高，能快速、特異地?cái)U(kuò)增任何DNA片斷。 PCR缺點(diǎn) 由于高靈敏度，使易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。 第二十七

14、張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月28 3. PCR產(chǎn)物分析（1）凝膠電泳分析法 可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 同時(shí)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。 （在待檢靶序列拷貝數(shù)多、且僅擴(kuò)增出一條帶時(shí)，用此法即可滿足檢測要求。）第二十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月29（2）點(diǎn)雜交分析法 該法有2種： 將擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定在膜上，每一個(gè)探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進(jìn)行雜交； 將不同的探針固定在膜上，再用有標(biāo)記的PCR產(chǎn)物 與之雜交。 本法有助于檢測突變DNA類型，用

15、于人類遺傳病診斷合某些基因的分析。 (當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)多條帶時(shí)，用此法更合適。)第二十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月30 (三)生物芯片 DNA芯片或基因芯片屬于生物芯片的一類。第三十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月31 (四) 基因測序 即，DNA堿基序列分析，這是最確切、最直接的基因診斷方法。 目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學(xué)裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。 第三十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月32 四. 基因診斷的臨床應(yīng)用(一) 遺傳病的基因診斷(二) 腫瘤的基因診斷(三) 感染性疾病的基因診斷第三十二張，PPT共六十二頁

16、，創(chuàng)作于2022年6月33 舉例： 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血 珠蛋白基因的第六個(gè)密碼子AT 表達(dá)產(chǎn)物：谷氨酸纈氨酸 一個(gè)堿基突變?nèi)笔?個(gè)Mst內(nèi)切酶位點(diǎn) 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb第三十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月34 53 53 1.1 kb 1.3kb Mst II酶切位點(diǎn)（CCTNATG）正?；蛲蛔兓?.3kb1.1kb0.2kb123 1、正常人 2、突變攜帶者 3、患者第三十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月35 第二節(jié) 基因治療 基因治療的概念 基因治療的總體策略 基因治療的基本程序 基因治療的現(xiàn)狀與展望第三十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于202

17、2年6月36一、基因治療概念 狹義概念 將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。 廣義概念 將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。 第三十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月37二、基因治療的總體策略 基因矯正 基因置換 基因增補(bǔ) 基因失活 “自殺基因”的應(yīng)用 免疫基因治療 耐藥基因治療 第三十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月38（一）基因矯正（gene correction） 對于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能； （二）基因置換（gene replacement） 用正?；蛟谠?/p>

18、位替換致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)； 第三十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月39（三）基因增補(bǔ)（gene augmentation） 將正?；?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。（四）基因失活（gene inactivation）： 指將特定的反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞，通過堿基互補(bǔ)作用與mRNA結(jié)合，阻斷腫瘤細(xì)胞中基因的異常表達(dá)，以抗腫瘤、抗病毒。 反義RNA: 干擾mRNA的互補(bǔ)RNA; 反義DNA: 干擾DNA的互補(bǔ)DNA.第三十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月40（五）“自殺基因”的應(yīng)用 自殺基因 這種基因?qū)?/p>

19、入受體細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。 自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對正常細(xì)胞則無傷害作用。 第四十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月41（六）免疫基因治療 將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。 （七）耐藥基因治療 在腫瘤化療過程中， 把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。第四十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月42 三、 基因治療的基本程序（一）治療性基因的獲得 在了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，

20、選擇對疾病有治療作用的特定基因。 如，對單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療； 對于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關(guān)的癌基因或抑癌基因用于基因治療。 治療性基因獲得的方法很多： 用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫獲得，從cDNA文庫獲取，PCR擴(kuò)增，人工合成等。第四十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月43（二）基因載體的選擇 基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。 常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。 病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體， 腺病毒載體， 腺相關(guān)病毒載體等； 非病毒載體： 與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療

21、基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。第四十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月44（三）靶細(xì)胞的選擇 基因治療的受體細(xì)胞有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞兩大類。 對生殖細(xì)胞進(jìn)行基因治療，可使該生殖細(xì)胞分化發(fā)育成長的個(gè)體及其后代均具有正?；?，理論上講是根治遺傳病的理想方法。 但由于涉及安全性和倫理學(xué)問題，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，只限于使用體細(xì)胞。 第四十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月45 人類基因治療中，將治療基因?qū)氚屑?xì)胞有兩種途徑。 一種為直接體內(nèi)療法（in vivo）： 即，將治療基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)組織細(xì)胞； 另一種為間接體內(nèi)療法（ex vivo）： 即，在體外先將治療基因?qū)?/p>

22、入培養(yǎng)的靶細(xì)胞內(nèi)，再將已獲得表達(dá)外源基因的遺傳修飾細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)，達(dá)到治療目的。第四十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月46 治療基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法 化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法（四）基因轉(zhuǎn)移方法 磷酸鈣法 DEAE葡聚糖法 電穿孔法 粒子轟擊法（基因槍法）第四十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月47 ( 五 ) 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇鑒定 標(biāo)記基因技術(shù) 基因缺陷型受體細(xì)胞技術(shù) 基因共轉(zhuǎn)染技術(shù) 分子雜交技術(shù) 外源基因表達(dá)鑒定 ( 六 ) 回輸體內(nèi) 將治療性基因修飾的細(xì)胞以不同方式回輸體內(nèi)。第四十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月48 四、

23、基因治療的應(yīng)用與展望 (一)基因治療應(yīng)滿足的條件： 1、單基因缺陷疾病 2、僅限體細(xì)胞的基因治療 3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。 4、治療效果應(yīng)勝過對病人的危害。 5、表達(dá)水平無需調(diào)控且無副作用。 6、需經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證安全可行。 第四十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月49 （二）基因治療有待解決的問題 1、難以獲得真正有治療作用的基因。 2、外源基因的表達(dá)難以在體內(nèi)精確調(diào)控。 3、體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會(huì)有 改變。 4、過多的外源蛋白對機(jī)體帶來可能的影響。 5、隨機(jī)整合潛在的威脅。 第四十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月50 第五十張，PPT共六十二頁，

24、創(chuàng)作于2022年6月51Eggs are coaxed to mature in a culture dish. Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it. 第五十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月52 While an egg is held still with a pipette, a needle is used to drill through the zona pellucida, removing a plug. 第五

25、十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月53 After ejecting the zona plug, the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material. 第五十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月54 A cumulus cell from another egg is taken up into the needle. Cells called fibroblasts (or

26、their nuclei) can also be used in this step. 第五十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月55 The cumulus cell is injected deep into the egg that has been stripped of its genetic material. 第五十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月56 The injected egg is exposed to a mixture of chemicals and growth factors designed to activate it to divide. 第五十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月57 After roughly 24 hours, the activated egg