單批次液體發(fā)酵 1 噸需養(yǎng)菌的發(fā)酵工藝設(shè)計(共13頁)

1、基因工程(jyn gngchng)工藝(gngy)設(shè)計設(shè)計題目：單批次液體(yt)發(fā)酵 1 噸需養(yǎng)菌的發(fā)酵工藝設(shè)計姓名：陳志強專業(yè)：生物工程學(xué)號：2012031202聯(lián)系方式成日期：2015.6.24 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系一、概述(i sh)1.1菌種菌種名稱：枯草芽孢(y bo)桿菌拉丁(l dn)學(xué)名 ：Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn1.1.1生理特性 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種。單個細(xì)胞0.70.823微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，橢圓到柱狀，位于

2、菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強烈降解核苷酸的酶系，故常作選育核苷生產(chǎn)菌的親株或制取5-核苷酸酶的菌種。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名枯草芽孢桿菌。1.1.2功能特性 1、能調(diào)節(jié)動物腸道菌群平衡 ,改善腸道微生態(tài)環(huán)境 ,促進動物生長和提高抗病力。 2、在不利環(huán)境條件下能以孢子形式存在 ,在飼料制粒、 貯存及

3、胃酸環(huán)境中仍能保持高活性。 3、能刺激動物免疫器官的生長發(fā)育 ,激活淋巴細(xì)胞 ,提高免疫球蛋白和抗體水平 ,增強細(xì)胞免疫和體液免疫功能 ,提高機體免疫力。 4、能自身合成消化性酶類 ,如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶和纖維素酶等 ,與內(nèi)源消化酶共同發(fā)揮作用 ,促進養(yǎng)分的消化吸收。文章以一株枯草芽孢桿菌為研究對象 ,對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化 ,為其規(guī)模化發(fā)酵提供依據(jù)。1.1.3作用機理 1、枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用； 2、枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，

4、促進有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸(r sun)等有機酸類，降低腸道PH值，間接抑制(yzh)其它致病菌生長； 3、刺激(cj)動物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力； 4、枯草芽孢桿菌菌體自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用； 5、能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。1.1.4菌種用途 1、該菌種對特殊菌體進行促芽孢和微膠囊包被處理，在孢子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，能耐氧化；耐擠壓；耐高溫，能長期耐60C高溫，在120C溫度下

5、能存活20分鐘；耐酸堿，在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，是飼料微生物中可100%直達(dá)大小腸的活菌。2、枯草芽孢桿菌以孢子狀態(tài)進入消化道后，迅速由休眠狀態(tài)復(fù)活，在短期內(nèi)繁殖成高含菌量的優(yōu)勢種群，消耗掉腸道內(nèi)大量氧氣，并能產(chǎn)生過氧化氫、細(xì)菌素，建立微生態(tài)平衡，促進有益厭氧微生物的繁殖，抑制有害細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏桿菌）的生長，從而預(yù)防腹瀉、下痢等腸胃道疾病。3、在快速繁殖過程中，產(chǎn)生大量多種維生素、有機酸、氨基酸、蛋白酶（特別是堿性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性飼料中復(fù)雜的有機物，從而促進消化吸收，提高飼料利用率，防止動物消化不良，出現(xiàn)“飼料便”等狀況發(fā)生。4、

6、該菌種安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少抗生素藥物的使用，增強免疫力。同時緩解動物不進食，生長緩慢等不良應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，恢復(fù)由于用藥造成的動物體質(zhì)下降，提高疫苗抗體水平等綜合抗病力。5、除臭驅(qū)蠅，減少污染，控制細(xì)菌性疾病，能減少糞便中氮、磷、鈣的排泄量，減少糞便臭味及有害氣體排放，表現(xiàn)為動物糞便臭味逐步減輕，減少飼料蛋白質(zhì)分解為氨氣浪費，從而減少環(huán)境污染。6、改善肉蛋奶品質(zhì)(pnzh)，生產(chǎn)“綠色(l s)肉”、“農(nóng)家(nn ji)蛋”、“無抗奶”，本品通過增強消化吸收功能，充分吸收利用飼料中營養(yǎng)成份及原料的天然色素，無需添加化學(xué)色素蘇丹紅、加麗素紅造成對人體的有害物質(zhì)及影響畜禽產(chǎn)品天然食用風(fēng)

7、味，可媲美家養(yǎng)畜禽肉。能天然增加動物產(chǎn)品著色度和食用風(fēng)味，豬只皮膚紅潤，毛色發(fā)亮；肉雞肉鴨顏色加深；改善蛋殼的質(zhì)量和顏色，蛋清厚稠，蛋黃鮮紅；水產(chǎn)動物顏色更加健康，無斑點。1.2菌種培養(yǎng)參數(shù)的選擇 1.2.1最佳生長時間的選擇 由下圖可知,發(fā)酵培養(yǎng)02 h 為枯草芽孢桿菌的生長停滯期 ,細(xì)菌數(shù)量極少;自 2 h 以后進入對數(shù)生長期 ,菌體數(shù)量急劇增多;在 12 h 達(dá)到生長高峰期 ,812 h為枯草芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期 ,菌體生長緩慢。自12 h后細(xì)菌數(shù)量開始減少 ,枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期。因此 ,采用 812 h 時的菌液作為菌種較合適 ,此時枯草芽孢桿菌為對數(shù)生長末期 ,既可保持高的細(xì)

8、胞活力 ,又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。1.2.2最佳接種量的選擇 分別選取1 %、 3 %、 5 %、 7 %和 9 %5 個接種量 ,在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h ,用稀釋平板計數(shù)法測其活菌數(shù)。由下圖可知 ,枯草芽孢桿菌生長的最適接種量為3% ,在1 %9 %范圍內(nèi)時 ,接種量對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響差異很小。1.2.3最佳(zu ji)裝液系數(shù)的選擇 選取(xunq)20、 40、 60、 80和100 mL 5個裝液量分別測定不同(b tn)裝液量對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響 ,在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h ,用稀釋平板計數(shù)法測其活菌數(shù)。1.2.4培養(yǎng)參數(shù)匯總表 菌種理論裝液系數(shù)理想裝液

9、系數(shù)接種量發(fā)酵時長初始pH溫度培養(yǎng)基成分枯草芽孢桿菌8%-20%8%3%12h6.03515 g/ L、 酵母浸出物5 g/ L 和MgSO4 5 g/ L根據(jù)優(yōu)化實驗及單因素實驗法確定了枯草芽孢桿菌的各發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)二、設(shè)計(shj)依據(jù)2.1總體生產(chǎn)(shngchn)規(guī)模單批次液體(yt)發(fā)酵1噸枯草 HYPERLINK /view/44590.htm t _blank 芽孢桿菌（需養(yǎng)菌）的發(fā)酵2.2 基本發(fā)酵工藝流程保藏菌種（平板劃線培養(yǎng)、 試管斜面培養(yǎng) ）菌種搖瓶培養(yǎng) 多級種子發(fā)酵罐培養(yǎng) 生產(chǎn)發(fā)酵 2.2.1 菌種的活化將冷凍保藏管中的菌種在斜面中活化（37 24h），并在平板中進行純化

10、（37 24h）。2.2.2 種子液制備取一環(huán)純化后的的菌種，接入裝量為20mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于180r/min中搖床中培養(yǎng) (37 18h)。 分別取1mL的種子液 ,接入五個盛有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中。置于150 r/ min搖床中 培養(yǎng)（30 12 h） 。2.2.3 一級發(fā)酵罐發(fā)酵將80mL的種子液接入裝有1.35L發(fā)酵液的2L發(fā)酵罐中，37, 180r/min培養(yǎng)12h。2.2.4 二級發(fā)酵罐發(fā)酵將1.35L的種子液接入裝有45L發(fā)酵液的70L發(fā)酵罐中，37, 180r/min培養(yǎng)12h。2.2.5三級發(fā)酵罐發(fā)酵將45L的二級種子液接入裝有15

11、00L發(fā)酵液的2.5t發(fā)酵罐中，180r/min培養(yǎng)12h。2.2.6 四級發(fā)酵罐發(fā)酵將1500L的三級種子液分別接入裝有20t發(fā)酵液的30t發(fā)酵罐和30t發(fā)酵液的50t發(fā)酵罐中，180r/min培養(yǎng)12h。2.3 工藝流程簡圖2.4發(fā)酵工藝設(shè)計理論參數(shù)與及工藝環(huán)節(jié)參數(shù)的選擇(xunz)原則 發(fā)酵工藝中影響因素主要包括生長時間(shjin)、溫度、PH、接種(jizhng)量、裝液量等。生長時間：理論上：發(fā)酵培養(yǎng)，02 h 為枯草芽孢桿菌的生長停滯期 ,細(xì)菌數(shù)量極少;2 h 以后進入對數(shù)生長期 ,菌體數(shù)量急劇增多; 12 h 達(dá)到生長高峰期，812 h為枯草芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期 ,菌體生長緩慢

12、。12 h后細(xì)菌數(shù)量開始減少 ,枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期。因此 ,我們在這里采用 812 h 時的菌液作為菌種較合適 ,此時枯草芽孢桿菌為對數(shù)生長末期 ,既可保持高的細(xì)胞活力 ,又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。溫度：理論上枯草芽孢桿菌在2540均可良好生長，其生長的最適溫度為35。在這里采用理論最適溫度。PH：采用初始PH 6.0接種量：在1 %9 %范圍內(nèi)時 ,接種量對枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的影響差異很小且在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h時，枯草芽孢桿菌生長的最適接種量為3% 。因此采用接種量為3%，在種子液接種到一級發(fā)酵罐中，可采用較大的接種量5%。理想的裝液系數(shù)為8%40%。這里我們采用8%。

13、根據(jù)上述結(jié)果匯總發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)發(fā)酵工藝設(shè)計理論參數(shù) 發(fā)酵培養(yǎng)類型理論接種比例理想接種比例理論裝液系數(shù)理想裝液系數(shù)三角瓶1-10%1-3%8-20%8%發(fā)酵罐1-10%1-3%60-85%60-70%發(fā)酵級別理論接種比例理想接種比例發(fā)酵液總量實際接種比例備注生產(chǎn)發(fā)酵1%-10%3%20t30t3%將生產(chǎn)發(fā)酵分為兩個罐生產(chǎn)四級種子1%-10%3%1500L3%三級種子1%-10%3%45L3%二級種子1%-10%3%1.35L3%一級種子1%-10%3%80mL5%三、發(fā)酵工藝流程(n y li chn)與設(shè)備流程設(shè)計主發(fā)酵罐的選定(xun dn)我所設(shè)計(shj)的是單批次1t，故根據(jù)1噸的生產(chǎn)產(chǎn)

14、量，以及發(fā)酵罐的理論裝液系數(shù)的范圍在60%-70%進行生產(chǎn)發(fā)酵罐容積的計算，因為考慮到產(chǎn)品供應(yīng)的市場的邊際收益和成本問題，將50t可以分成0.2t和0.3t進行生產(chǎn)。計算如下0.2t1000L/t=200L 200L60%=333.33L200L70%=285.71L生產(chǎn)發(fā)酵罐0.2t的選擇范圍在333.33L-285.71L根據(jù)發(fā)酵罐的規(guī)格，所以選擇300L的發(fā)酵罐進行生產(chǎn)200L300L=66.7%此時(c sh)實際裝液率為66.7%0.3t1000L/t=300L300L60%=500L300L70%=428.57L生產(chǎn)(shngchn)發(fā)酵罐30t的選擇(xunz)范圍在500L-4

15、28.57L根據(jù)發(fā)酵罐的規(guī)格，所以選擇450L的發(fā)酵罐進行生產(chǎn)300L450L=66.7%此時實際裝液率為66.7%種子罐的選定 1四級種子罐根據(jù)枯草芽孢桿菌的接種量的理論范圍1-10%，我們選擇3%做為實際接種量500L3%=15L15L60%=25L15L70%=21.43L二級發(fā)酵罐的選擇范圍在21.43L-25L根據(jù)種子罐的規(guī)格，所我選擇25L的二級種子罐進行生產(chǎn)15L25L=60%此時實際裝液率為60%2三級種子罐根據(jù)枯草芽孢桿菌的接種量的理論范圍1-10%，以及對理想接種量3%的考慮,同時考慮二級種子罐的規(guī)格大小15L3%=0.45L0.45L60%=0.75L0.45L70%=0

16、.64L以及發(fā)酵罐的選擇范圍是0.64L-0.75L根據(jù)種子罐的規(guī)格，選擇0.7L的一級種子罐進行生產(chǎn)0.45L0.7L=64.3%此時實際裝液率為64.3%3二級種子罐根據(jù)枯草芽孢桿菌的接種(jizhng)量的理論范圍1-10%，以及(yj)對理想接種量3%的考慮(kol),同時考慮二級種子罐的規(guī)格大小0.45L3%=0.0135L0.0135L60%=0.0225L0.0135L70%=0.0193L以及發(fā)酵罐的選擇范圍是0.0192L-0.0225L根據(jù)種子罐的規(guī)格，選擇0.022L的一級種子罐進行生產(chǎn)0.0135L0.022L=67.5%此時實際裝液率為67.5%4一級種子搖瓶數(shù)量型號

17、的選擇根據(jù)枯草芽孢桿菌的接種量的理論范圍1-10%，以及對理想接種量3%的考慮,同時考慮三角瓶的裝液系數(shù)是8%-20%，理想裝液系數(shù)是8%我們選擇5%做為實際接種量，選擇8%為實際裝液率1.35L5%=0.675L=67.5mL67.5mL8%=843.75mL這樣我們可以選擇5個250mL的三角瓶進行培養(yǎng)根據(jù)實際操作情況為了避免染雜菌，我們5+1=6個三角瓶進行培養(yǎng)5空氣壓縮機的選擇根據(jù)發(fā)酵罐每分鐘需氧量來確定空氣壓縮機的型號。根據(jù)轉(zhuǎn)子流量計1:1的比值，按照最大的裝液系數(shù)70%計算主發(fā)酵罐0.4t每分鐘需空氣為300L70%=210L主發(fā)酵罐0.6t每分鐘需空氣為500L70%=350L種

18、子罐每分鐘需空氣的量為（25L+0.7L+0.02L）70%=18L總共需要空氣的量為210L+350L+18L=578L 578L1000L/t=0.578t所以所選擇的空氣壓縮機應(yīng)能夠供應(yīng)0.578t/min的空氣量同時考慮空氣壓縮機本身的使用情況，不能全動力投入使用，需要留一定的額度，而保證其壽命及生產(chǎn)?？諌簷C的體積(tj)流量為0.58m3/min，所以(suy)我們選擇0.60m3/min的空壓機.又因回轉(zhuǎn)式空壓機結(jié)構(gòu)簡單易損件少，容易(rngy)維護，操作，并且有安裝靈活的特點。其氣量要求在0.85 m3/min-85 m3/min。故可以采用0.60 m3/min的空壓機。6鍋爐

19、的選擇鍋爐的種類有燃煤鍋爐，燃油鍋爐，燃?xì)忮仩t，根據(jù)地方管理的要求，及環(huán)境保護的原則和效益最大化我們選擇燃?xì)忮仩t。7實際確定的發(fā)酵設(shè)備選型推算結(jié)果參數(shù)匯總發(fā)酵級別發(fā)酵液總量理論裝液系數(shù)實際裝液率需要設(shè)備容量選用設(shè)備規(guī)格及數(shù)量設(shè)備型號及廠家一級種子67.5mL8%-20%8%250mL三角瓶6250ml三角瓶上海鼎國生物技術(shù)有限公司二級種子1.35L60%-70%67.5%2L發(fā)酵罐12L發(fā)酵罐上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司三級種子45L60%-70%64.3%70L發(fā)酵罐170L發(fā)酵罐上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司四級種子1500L60%-70%60%2500L發(fā)酵罐12500L發(fā)酵罐上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司生產(chǎn)發(fā)酵1t60%-70%66.7%80t發(fā)酵罐1SDL系列不銹鋼多聯(lián)發(fā)酵系統(tǒng)上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司附屬設(shè)備設(shè)備名稱容積流量/蒸發(fā)量型號廠家備注空氣壓縮機60m3/minSA-75A/W12.3/0.8上海復(fù)生 噴油螺桿回轉(zhuǎn)式空壓機臥式1/2噸燃油/氣鍋爐/蒸汽鍋爐5000kg/hWNS1.0-WNS2.0-1 HYPERLINK /china/2/manufacturers/905142/main/.html 上海華征特種鍋爐制造有限公司使用煤氣，天然氣SDL系列機械攪拌多聯(lián)發(fā)酵系統(tǒng)特點及主要參數(shù)可控參數(shù) 公稱容積：5L100000L裝料系數(shù)：70%8