質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳 (2)

1、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1一、目的要求二、原理1、類型：（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳 適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達(dá)1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進(jìn)行純化，也稱PAGE純化。2 （2）瓊脂糖凝膠電泳 可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.50.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp50kb。電泳結(jié)果用熒光染料染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。3瓊脂糖：從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿a

2、-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104105的長鏈。 瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。4不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍瓊脂糖/標(biāo)準(zhǔn)高強(qiáng)度低熔點(diǎn)低粘度低熔點(diǎn)0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb2.0100bp3kb100bp3kb3.0500bp1kb500bp1kb

3、4.0100bp500bp6.010bp100bp52、DNA電泳影響因素主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。（1）DNA分子大小 DNA分子越大在膠中摩擦阻力就越大，泳動也越慢， 遷移速率與線狀DNA分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比。（2）DNA分子構(gòu)型 相同分子量質(zhì)粒DNA，構(gòu)型不同電泳時受的阻力不同，泳動速率不同。常規(guī)電泳中質(zhì)粒DNA分子的3種構(gòu)型泳動速率：超螺旋最快、線狀次之，開環(huán)最慢。 6（3）膠濃度 （4）電場強(qiáng)度：根據(jù)需要選擇合適電壓。 為了盡快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所用電場強(qiáng)度約為5V/cm， 但分辨率不高。 精確測定DNA分子大小時，電壓1V/cm。（5）溴化乙錠 簡稱EB，電泳中的染色劑

4、。7具有扁平 結(jié)構(gòu)，能嵌入到DNA堿基對間，對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。8（6）電泳緩沖液 常用DNA電泳緩沖液（1000ml) TAE （50） 242gTris 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 9 TBE（5） 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TPE （10） 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%，1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 10 3、DNA電泳上樣緩沖液主要作用如下：（1）螯合Mg2，防止電泳過程中DNA

5、被降解（2）增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。（3）指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。 114、 DNA電泳上樣量的控制 分析性電泳中，一般樣品投入量達(dá)50100ng/帶，即可觀察到清晰結(jié)果。 珍貴DNA樣品則上樣量達(dá)電泳的最低分辨率510ng/帶也可。 125、 DNA電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量（DNA Marker）目前各廠商開發(fā)了各種類型的標(biāo)準(zhǔn)分子量。13146、DNA染料（1）溴化乙錠 簡稱EB，電泳中的染色劑。15（2）熒光染料 GoldViewTM