有關(guān)紫杉醇生產(chǎn)的影響因素與對策甄選

1、精品 word. / 4doc 可編輯有關(guān)紫杉醇生產(chǎn)的影響因素與對策 .（優(yōu)選）有關(guān)紫杉醇生產(chǎn)的影響因素與對策紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉科（Taxaceae紅豆杉屬（Taxus）植物樹皮、針葉中分 離出的一種四環(huán)二萜酰胺類化合物 , 它能有效地治療晚期卵巢癌 , 乳腺癌和其它 癌癥, 被稱為是過去幾十年中發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物。 1992 年12月29日, 美國 FDA正式批準(zhǔn)紫杉醇作為治療晚期卵巢癌的新抗癌藥物 （商品名為Paclitaxel）。由 于紫杉醇在植物體中的含量相當(dāng)?shù)?，大約從3 6棵60 100年生大樹的樹皮中才能 提取到1g紫杉醇，可治療一個癌癥患者。目前全球每年200kg紫

2、杉醇的消耗量意味 著要砍伐 100萬棵紅豆杉大樹 , 隨著紫杉醇應(yīng)用范圍的擴大 , 其需求量必然會逐 年增加，而紅豆杉樹生長速度相當(dāng)慢，直徑20cm的樹需生長100年！因此，伐樹 生產(chǎn)紫杉醇的方法不僅會嚴(yán)重破壞該樹的長期生存和分布 , 也根本無法滿足人們 對紫杉醇的需求。尖銳的供需矛盾在醫(yī)學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中引起了一場非同 尋常的廣泛研究 , 以增加這種化合物的來源。目前生產(chǎn)紫杉醇的主要方法紫杉醇的生產(chǎn)方法主要是提取分離和化學(xué)合成，提取分離的方法按來源不同 又可分為三大類 : 從植物中分離提取、從真菌中分離提取及從培養(yǎng)細(xì)胞中分離提 取。直接從紅豆杉科植物中分離提取 紫杉醇含量與種、部位、生長

3、年限、生長環(huán)境等因素有關(guān)。在所有紅豆杉中短葉紅豆杉中紫杉醇含量最高；從生長時間上看，生長時間越長的器官或組織紫 杉醇含量越高；從生長環(huán)境上看，生長在陰處的樹皮比暴露在日光下的高；就部 位來看，一般樹皮中紫杉醇含量較高， 短葉紅豆杉樹皮中紫杉醇含量可達(dá) 0.069%。 據(jù)估算，從2000 3 00（棵稀有的紫杉樹皮中只能提取1 kg紫杉醇，而對1例病人制 備充足的藥物需 3 4棵百年的老紅豆杉樹。這要求人工栽培的紅豆杉品種紫杉醇 含量高、生長迅速。 目前，曼地亞紅豆杉能相對較好地滿足這些要求，它是一 個雜交品種，生長迅速3 5day后可收獲兩次枝葉，其針葉中紫杉醇含量為0.017% 0.046%

4、。因此，人工種植該品種生產(chǎn)紫杉醇的成本不會低，但是，選育優(yōu)良品 種提取紫杉醇無疑是一個有價值的研究方向。直接從紫杉醇產(chǎn)生菌中提取 紫杉醇產(chǎn)生菌主要是一些紅豆杉的內(nèi)生真菌。真菌中最高紫杉醇含量為 185.4g/ L,可見，當(dāng)前利用微生物發(fā)酵方法產(chǎn)生紫杉醇的量很低，難以達(dá)到工業(yè)化生 產(chǎn)的要求。而且，真菌自身合成紫杉醇的途徑還未見報道，自身是否存在紫杉醇 的合成途徑還需進(jìn)一步研究探索。此生產(chǎn)方法的前景還不明朗?；瘜W(xué)合成法化學(xué)合成是生產(chǎn)藥物的一條重要途徑，許多天然藥物 （如一些抗生素 ） 除了可 從生物體內(nèi)提取外，還可通過化學(xué)的方法合成。紫杉醇的藥效被發(fā)現(xiàn)以來，其化 學(xué)合成的方法一直受到重視并得到很多

5、的研究探索。 迄今為止，在生產(chǎn)上有價 值的紫杉醇的全合成尚未取得成功。紫杉醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜，母核有9個手性中心，因 此應(yīng)有 2 048個非對映異構(gòu)體，紫杉醇的半合成是以天然來源的 baccatin 或 10-去 乙酰baccat in為原料，通過13位酯化得到紫杉醇或其它半合成衍生物。此法首先 合成側(cè)鏈，然后把側(cè)鏈接到baccatin或10-去乙酰baccatin上去。紫杉醇的半合成 法的問題主要在于： 1） 合成原料在植物中含量不高，分離成本較高。 2） 每一步 反應(yīng)得率低，而且有時會碰到選擇性較差的問題。所以，無論是全合成還是半合 成目前都取得了成功，但都難以應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。4 利用紅

6、豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇大規(guī)模地培養(yǎng)微生物細(xì)胞實現(xiàn)了許多種抗生素的大量生產(chǎn)，極好地滿足了病 人對抗生素的需求，挽救了無數(shù)人的生命?？股厥俏⑸锏拇紊x產(chǎn)物，紫 杉醇是植物細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物， 能否通過大規(guī)模的植物細(xì)胞培養(yǎng)大量獲取紫杉 醇很有研究價值。就現(xiàn)有的報道來看，這一生產(chǎn)方法受到了許多學(xué)者的重視，許 多研究者在高產(chǎn)細(xì)胞系的選擇和代謝調(diào)控方面進(jìn)行了大量的卓有成效的研究。 影響紫杉醇生產(chǎn)的幾個因素：1.碳源碳源作為植物生長的基質(zhì)和能量來源，對細(xì)胞生長和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)有 很大影響。在短葉紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，比較了 20g/L的蔗糖、乳糖、半乳糖、 葡萄糖、果糖對細(xì)胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)半乳糖

7、和蔗糖最有利于細(xì)胞生長。在高起 始糖濃度的培養(yǎng)基中，果糖最能刺激紫杉醇的合成。與高起始糖濃度培養(yǎng)的細(xì)胞 相比，采用補糖的方法，紫杉醇產(chǎn)量在靜止期可顯著增加。南方紅豆杉細(xì)胞對蔗 糖的消耗有一個臨界點，即培養(yǎng)液中總殘留有 1g/L的蔗糖不能被吸收，而培養(yǎng)液 中濃度為30g/L的蔗糖對細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成最為有利。蔗糖大部分被降解成葡萄 糖和果糖，其中葡萄糖有利于細(xì)胞的前期生長以獲得大量的懸浮細(xì)胞，在中期添 加果糖有利于細(xì)胞培養(yǎng)后期合成紫杉烷類化合物。氮源在氮源組成中，較低的NH4/NO3比有利于細(xì)胞的快速生長，而其他無機鹽濃度 與細(xì)胞生長之間不存在這種關(guān)系。培養(yǎng)基中高濃度的NO3有利于云南紅豆杉愈傷

8、組織的生長，而高濃度的NH4則抑制愈傷組織的生長，但可顯著提高紫杉醇的含 量。在無機氮全部為銨態(tài)氮的處理中，愈傷組織接種 1周后就變成磚紅色，增殖 較少，其生長指數(shù)顯著低于對照，但紫杉醇含量較對照高1倍。光照 在離體無菌培養(yǎng)條件下，細(xì)胞處于異養(yǎng)狀態(tài)，且培養(yǎng)基中已經(jīng)添加了足夠的 碳源，光照并非用來提供光合作用的能量，但是不同的光照時間和光照強度仍然 會對細(xì)胞代謝產(chǎn)生一定的影響。 白光對東北紅豆杉愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中紫 杉醇積累的影響發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時懸浮細(xì)胞的生長量是白光培養(yǎng)下的2-3倍，紫杉醇的產(chǎn)量也是白光培養(yǎng)下的 3倍。其原因可能有 2個：一是紫杉醇（二萜）的遠(yuǎn)程 前體是甲戊二羥酸（MVA）

9、,而MVA的合成量與甲戊二羥酸酰輔酶 A還原酶（HMGR） 的活性正相關(guān)，光照會導(dǎo)致HMGR勺活性降低，最終導(dǎo)致紫杉醇積累的降低；二 是光照會抑制紫杉醇的胞外分泌，從而可能導(dǎo)致胞內(nèi)合成過程的反饋性抑制。溫度雖然大多數(shù)植物細(xì)胞的適宜生長溫度范圍較寬 (22-30C )，但在紅豆杉細(xì)胞生 長和紫杉醇合成過程中，適宜溫度還是起著一定作用。低溫處理對紅豆杉細(xì)胞懸 浮培養(yǎng)的影響，比較了分別在2、4、6、8C下處理12,24, 36h以及恢復(fù)12,24, 36h 對紅豆杉細(xì)胞分裂指數(shù)的影響。結(jié)果表明，在 2C下處理12H,恢復(fù)12h紅豆杉細(xì) 胞分裂指數(shù)提高了 115%,說明低溫對其細(xì)胞生長具有誘導(dǎo)作用。中

10、國紅豆杉在 24C下培養(yǎng)一段時間后，升高溫度至29C，再培養(yǎng)14-21d時，紫杉醇含量可達(dá)到 137.5mg/L,如果21d后仍持續(xù)保持29C，紫杉醇含量可在這一峰值保持42d,由 此可見,溫度與紫杉醇合成途徑之間有明顯的相關(guān)性。pH 值培養(yǎng)基pH值在4.87.8時，東北紅豆杉愈傷組織的生長沒有明顯差異。但是培 養(yǎng)基pH值對東北紅豆杉和南方紅豆杉愈傷組織生長、紫杉醇含量與苯丙氨酸解氨 酶活性的影響后，pH值的高低對紅豆杉愈傷組織生長及紫杉醇含量影響很大，且PAL舌性的大小與紫杉醇含量呈正相關(guān)。即 PAL舌性高，紫杉醇含量往往也高。這 可能是因為：在PA啲作用下，由苯丙氨酸脫氨基而形成的肉桂酸參

11、與了 Wintersein酸的形成，而Wintersein酸是紫杉醇合成的前體。值得注意的是，有利 于愈傷組織生長的pH值卻不利于紫杉醇的積累，而且往往是愈傷組織生長越好，紫 杉醇含量越低 ;生長狀態(tài)較差的 ,紫杉醇含量反而可能增高。氣體植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時需要氧氣02，同時也能非光合地固定一定濃度的二氧 化碳，只有O2和CQ的濃度達(dá)到某一平衡點時，細(xì)胞才會很好地生長，乙烯是植物 細(xì)胞在不良刺激下產(chǎn)生的一種防御性氣體 ,對紫杉醇產(chǎn)量的提高不利。 對于漿果紅 豆杉的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，在培養(yǎng)基中維持低濃度的 CQ并移走乙烯，同時提供充足 的02能夠促進(jìn)細(xì)胞生長,增加紫杉醇的產(chǎn)量。 擴大紫杉醇資源的途徑

12、主要有以下幾個：一、進(jìn)行紅豆杉樹木的扦插、育苗通過優(yōu)株選擇、 品系匹配、 控制授粉進(jìn)行良種選育 , 繁育出高生長量、 高紫杉 醇含量的雜交種苗。 南方紅豆杉具有的高生物量性狀與北方紅豆杉具有的高抗逆 性狀和紫杉醇高含量性狀通過種間雜交組合 , 有望提高原料植物的紫杉醇生產(chǎn) 力。研究表明，對紅豆杉采用營養(yǎng)袋作基質(zhì)，用ABT生根粉浸基部12小時，在室 外常規(guī)管理下 , 生根率高達(dá) 70%90%,且扦插苗根系發(fā)達(dá) , 占用土地少 , 便于管理 , 移栽成活率高。二、進(jìn)行紫杉醇的化學(xué)合成與半合成全合成紫杉醇。 一般采用兩種合成途徑 , 一種是線性合成法 , 另一種是收斂途 徑。兩種途徑均需要 2530

13、 步復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過程 , 若實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇 , 還有一定的距離。半合成紫杉醇。主要是從紅豆杉的針葉中獲得高含量的 10- 去 乙酰漿果赤霉素皿,以此為原料半合成紫杉醇以及同系物taxotere,taxotere的抗 腫瘤作用與紫杉醇相似。在臨床試驗中 , 采用 taxotere 治療晚期腫瘤患者 , 有效 率達(dá) 40%。由于紅豆杉針葉產(chǎn)量大、 再生能力強 , 因此 , 半合成紫杉醇的原料是很 豐富的。三、進(jìn)行紫杉醇的組織培養(yǎng)近年來 , 國內(nèi)外進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)的紅豆杉或變種已超過 10 個, 其中大部分 被證實可產(chǎn)生紫杉醇。研究較集中的是歐洲紅豆杉、太平洋紅豆杉、東北紅豆杉 等 , 選作

14、誘導(dǎo)愈傷組織的外植體包括根、莖、葉、樹皮、形成層、大配子體、種 子胚、假種皮、幼苗胚軸等。還有人用發(fā)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞離體培養(yǎng)生產(chǎn)紫 杉醇及其類似物 , 誘導(dǎo)其發(fā)根 , 然后大量培養(yǎng)發(fā)根 , 從發(fā)根中提取紫杉醇。由于 發(fā)根速度較快 , 且遺傳性狀穩(wěn)定 , 有望成為工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的一條新途徑。四、進(jìn)行紫杉醇的細(xì)胞培養(yǎng)自1989年首次利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇后 , 紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究 報告呈逐年增加趨勢 , 研究范圍涉及細(xì)胞株系的選擇 , 細(xì)胞生長、紫杉醇生產(chǎn)及 營養(yǎng)成分消耗的動力學(xué)、誘導(dǎo)物、菌體、激素的種類和濃度、糖的種類和濃度、 生物過程的偶合、生物反應(yīng)器的種類、培養(yǎng)環(huán)境等方面的內(nèi)容。目前利用細(xì)胞培 養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇的研究已經(jīng)進(jìn)入到生物反應(yīng)器放大階段。五、進(jìn)行紫杉醇產(chǎn)生菌的工程菌株構(gòu)建與發(fā)酵生產(chǎn)利用生物技術(shù)合成紫杉醇是近年來國內(nèi)外的研究熱點。其中微生物生產(chǎn)紫杉 醇的研究取得了突破性進(jìn)展 , 但就目前水平來說 , 還達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵問題是紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇 產(chǎn)量的提高 , 這也是構(gòu)建工程菌株的關(guān)鍵 , 目前還有許多關(guān)鍵技術(shù)問題需要解 決。研究者認(rèn)為有兩個設(shè)想是可行的 : 其一是從紅豆杉中分離紫杉醇基因組