提高固體支撐雙層類脂膜穩(wěn)定性的研究

1、提高固體支撐雙層類脂膜穩(wěn)定性的研究甘禮華收稿日期：20080617基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(20673076)；上海市科委納米專項(xiàng)基金(0652nm030; 0752nm006)作者簡介：甘禮華(1964), 男, 教授, 工學(xué)博士, 博士生導(dǎo)師. 主要研究方向?yàn)槟z體與表面化學(xué)、納米材料物理與化學(xué). E-mail： HYPERLINK mailto:ganlh ganlh，劉明賢，宰正蓓，陳龍武(同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)系，200092上海)摘要：以卵磷脂的正癸烷溶液作為成膜液，在不銹鋼絲新生金屬端面上獲得了固體支撐雙層類脂膜(S-BLMs)。采用循環(huán)伏安法研究了S-BLMs的成膜過程，以及提高S-B

2、LMs穩(wěn)定性的方法，結(jié)果表明：在成膜液中引入適量的膽固醇，可使卵磷脂分子在不銹鋼絲新生端面上的排列更加緊密有序，從而提高S-BLMs的穩(wěn)定性；對不銹鋼絲新生端面進(jìn)行表面處理，可有效擴(kuò)大能夠形成S-BLMs的支撐面的直徑。此外，同時采用添加膽固醇和不銹鋼絲表面處理的方法，可進(jìn)一步提高S-BLMs的穩(wěn)定性。關(guān)鍵詞：固體支撐雙層類脂膜；卵磷脂；循環(huán)伏安法；穩(wěn)定性中圖分類號： Q734 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0253374X(2009)-09Research on the Improvement of the Stability of Solid Supported Bilayer Lipid M

3、embranesGAN Lihua, LIU Mingxian, ZAI Zhengbei, CHEN Longwu(Department of Chemistry, Tongji University, Shanghai 200092, China)Abstract: Solid supported bilayer lipid membranes (S-BLMs) was fabricated on the regenerated metal surface of stainless steel by using lecithin-decane solution as S-BLMs form

4、ing solution. The forming process of S-BLMs was researched by cyclic voltammetry, and the means to improve the stability of the S-BLMs were also investigated. The results indicate that the stability of the S-BLMs could be improved effectively by the introduction of some cholesterol into the lecithin

5、-decane solution since it could make the arrangement of lecithin molecules more compact and order on the regenerated metal surface. On the other hand, the treatment of the regenerated surface of stainless steel could enlarge the diameter of the support which has the ability to form S-BLMs. In additi

6、on, the stability of S-BLMs could be further improved by the addition of cholesterol as well as the surface treatment of stainless steel.Keyword: S-BLMs; lecithin; cyclic voltammetry; stability生物膜是細(xì)胞和各種細(xì)胞器表面所包裹的一層極薄的膜系結(jié)構(gòu)。生物膜具有高度選擇性和半透性，其主要功能有：物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息分子識別和信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換等。在生命過程中，生物膜的這些特殊結(jié)構(gòu)和功能起著十分重要的作用。要認(rèn)識生

7、命現(xiàn)象和研究生命的本質(zhì)，首先必須弄清發(fā)生在生物膜上的各種物理、化學(xué)過程。然而，由于天然生物膜的組成、結(jié)構(gòu)、功能的復(fù)雜性，在原位進(jìn)行直接的觀測和研究是十分困難的，因此，制備其模擬體系是進(jìn)行各種研究的基礎(chǔ)和前提1-6。雙層類脂膜(bilayer lipid membranes, BLMs)是由磷脂等組成的液晶態(tài)雙分子層超分子組裝體7，它作為生物膜的模擬體系，既具備生物膜基本構(gòu)架，又克服了生物膜本身的復(fù)雜性，是研究生物膜體系的極佳模型，因此，人工模擬雙層類脂膜作為生物膜模型的研究得到了人們的廣泛重視，在環(huán)境污染物、生命活性物質(zhì)的檢測，藥物與生物膜之間的相互作用等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景8-12。雙層

8、類脂膜主要有平板雙層類脂膜和固體支撐雙層類脂膜(solid supported bilayer lipid membranes, S-BLMs)。平板雙層類脂膜作為最早的雙層類脂膜模型，其通透性和存在狀態(tài)都與真實(shí)的生物膜相近。然而，這種膜容易破裂，穩(wěn)定性較差，使許多研究不能深入進(jìn)行7，因此，提高BLMs的穩(wěn)定性是非常重要的。Tien等提出的S-BLMs，可在較大的電位掃描范圍內(nèi)獲取有關(guān)生物膜電子傳遞、離子運(yùn)送、生物免疫和神經(jīng)傳導(dǎo)等方面的重要信息8。與平板雙層類脂膜相比，S-BLMs的穩(wěn)定性得到了很大的提高。隨著對S-BLMs研究的廣泛開展，研究發(fā)現(xiàn)，S-BLMs的穩(wěn)定性可通過在成膜液中摻入其它

9、組分而大大改變，比如：摻入染料、多肽、膜蛋白等13。本文利用卵磷脂的正癸烷溶液作為成膜液，在不銹鋼絲新生金屬端面上獲得了S-BLMs。采用循環(huán)伏安法研究了S-BLMs的成膜過程，從構(gòu)成S-BLMs的成膜液組成和成膜基底兩個方面，研究了提高S-BLMs穩(wěn)定性的方法。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 實(shí)驗(yàn)材料卵磷脂、膽固醇、氯化鉀、乙醇、丙酮為分析純試劑(中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)，正癸烷(99%)為進(jìn)口分裝。將卵磷脂溶解于正癸烷中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的卵磷脂的正癸烷溶液作為成膜液。電解液為0.1 molL-1的氯化鉀溶液。CHI660電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；飽和甘汞電極、鉑電極(上海光電器件廠)，

10、包封聚四氟乙烯的不銹鋼絲為實(shí)驗(yàn)室自制：取直徑約為0.4 mm的不銹鋼絲，截成10 cm左右的小段，用純凈水、乙醇、丙酮依次清洗，晾干后用相應(yīng)直徑的聚四氟乙烯管包覆，使除了頭尾外，其余部分絕緣。用鋼絲鉗截斷尾部，使不銹鋼絲端面和聚四氟乙烯管齊平，制作好的電極清洗后備用。1.2 實(shí)驗(yàn)過程將包覆聚四氟乙烯的不銹鋼絲一端在成膜液中切斷，使端面出現(xiàn)新生金屬并和聚四氟乙烯管齊平，把剛切斷的不銹鋼絲電極迅速插入配好的純卵磷脂成膜液中，浸漬15 min，使其自動生成穩(wěn)定的S-BLMs。采用三電極體系，將包覆聚四氟乙烯的不銹鋼絲作為工作電極，鉑電極為輔助電極，甘汞電極為參比電極，用CHI660電化學(xué)工作站測定體

11、系的伏安特性曲線，掃描范圍為-0.2 0.2 V，掃描速率為0.1 Vs-1。1.3成膜液和成膜基底對S-BLMs穩(wěn)定性的影響在S-BLMs 體系中，考查成膜液組成和成膜基底對S-BLMs穩(wěn)定性的影響，其具體方法如下：(1)在成膜液中添加膽固醇，以直徑為0.4 mm的不銹鋼絲作為工作電極，采用循環(huán)伏安法，考察膽固醇對S-BLMs穩(wěn)定性的影響；(2)取直徑分別為0.8 mm和1.0 mm的不銹鋼絲電極，研究以1200目的金相砂紙打磨處理不銹鋼絲端面前后對S-BLMs穩(wěn)定性的影響；(3)考察在成膜液和摻雜膽固醇的成膜液中，直徑為0.8 mm和1.0 mm的不銹鋼絲電極表面處理前后對S-BLMs穩(wěn)定

12、性的影響。2結(jié)果與討論2.1 雙層類脂膜的形成過程S-BLMs的形成過程主要基于新生金屬表面和具有兩親性的類脂分子間的相互作用。當(dāng)包有親脂的聚四氟乙烯的金屬絲在脂溶液中被切開時，新生金屬表面有強(qiáng)的吸水性，依據(jù)金屬聚合物界面理論，它可以定向吸附類脂分子。把吸附類脂滴的金屬絲插入0.1 molL-1的 KCl溶液后，脂滴便在親水力、親脂力的共同作用下，逐漸變薄，兩親分子的排列也由無序變?yōu)橛行?，最終形成穩(wěn)定雙層結(jié)構(gòu)。圖1為不銹鋼絲電極上S-BLMs成膜前后的循環(huán)伏安曲線。從圖1可以看出，在同樣的電壓條件下，通過成膜液中的不銹鋼絲電極上的電流比通過空白不銹鋼絲電極上的電流小1個數(shù)量級以上。不銹鋼絲電極

13、插入成膜液后，電極上的電阻顯著增加，表明成膜液中的不銹鋼絲電極上形成了S-BLMs， S-BLMs的形成大大降低了電極的導(dǎo)電性，使得成膜電極的電流明顯低于空白電極。在成膜液中，不銹鋼絲電極上的循環(huán)伏安曲線在最初的幾分鐘內(nèi)變化較大，這表明類脂分子處于無序的運(yùn)動狀態(tài)，此階段為S-BLMs的初步形成階段；隨著掃描過程的不斷繼續(xù)，處于無序狀態(tài)的卵磷脂分子在極性溶液和電場的雙重作用下，在不銹鋼絲新生金屬端面上重新有序化排列，逐漸形成穩(wěn)定的S-BLMs?？瞻纂姌O 電壓 / V 電流 / (10-8A) 電流 / (10-8A)成膜電極 電壓 / V a b圖1 不銹鋼絲空白電極(a)和S-BLMs(b)的

14、循環(huán)伏安曲線 Fig.1 Cyclic voltammetric curves of blank electrode (a) and the S-BLMs (b)2. 2 膽固醇對S-BLMs穩(wěn)定性的影響成膜液的組成對S-BLMs的形成過程和電化學(xué)性質(zhì)有著重要的影響13。卵磷脂是生物膜的主要成份，它是類脂類物質(zhì)，具有兩親性和界面活性，易于以雙層的形式自組裝。膽固醇也是生物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)之一。本文在成膜液中添加適量的膽固醇，考察了它對S-BLMs穩(wěn)定性的影響。圖2是添加膽固醇前后所得的S-BLMs 30 min后的循環(huán)伏安曲線。由圖2可知，與未添加膽固醇時相比，添加膽固醇后的S-B

15、LMs的循環(huán)伏安曲線的形狀更為扁平，也就是說，在相同電壓下，通過插入添加膽固醇后的成膜液中的電極上流過的電流要小一些，這表明在添加膽固醇的成膜液中形成的S-BLMs的膜電阻比未添加膽固醇時形成的S-BLMs的膜電阻要大。對S-BLMs不斷進(jìn)行掃描，然后對所得循環(huán)伏安圖進(jìn)行求導(dǎo)，得到添加膽固醇前后的S-BLMs的膜電阻隨掃描時間的變化曲線，如圖3所示。由圖3可知，無論添加膽固醇與否，在掃描的前幾分鐘內(nèi)，S-BLMs的膜電阻都急劇上升，這是由于在形成穩(wěn)定的S-BLMs前，卵磷脂分子運(yùn)動突然加劇以及分子的無序運(yùn)動引起的。410 min后膜電阻開始迅速下降，約30 min后膜電阻趨于穩(wěn)定。這表明在新生

16、金屬端面上，卵磷脂分子的排列逐步變得有序，30 min后形成了穩(wěn)定的S-BLMs。從圖3還可以看出，添加膽固醇后的S-BLMs的膜電阻約是未添加膽固醇時的2.5倍，表明膽固醇的加入使得卵磷脂分子在成膜基底上的排列變得更加緊密，從而使S-BLMs的膜電阻顯著增加。此外，添加膽固醇后的S-BLMs的膜電阻在120 min左右時就基本不再發(fā)生變化，而未添加膽固醇的S-BLMs的膜電阻隨時間一直有微小變化，直到1200 min之后才基本不變。因此，成膜液中添加膽固醇可明顯減少形成穩(wěn)定的S-BLMs所需要的時間，提高S-BLMs的成膜效率。圖2成膜液中添加膽固醇前后S-BLMs的循環(huán)伏安曲線Fig. 2

17、 Cyclic voltammetric curves of the S-BLMs with and without the addition of cholesterol into the S-BLMs forming solutiona：未添加膽固醇 b：添加膽固醇 電流 / (10-8A)電壓 / V 添加膽固醇 未添加膽固醇 電阻 / (108)時間 / min 圖3 S-BLMs的膜電阻隨掃描時間變化曲線Fig. 3 Relationship between the resistance of S-BLMs and scanning time膽固醇的添加導(dǎo)致S-BLMs的膜電阻增加，

18、成膜時間減少，其原因可能是因?yàn)槟懝檀荚谡{(diào)節(jié)膜的流動性中起著的作用。研究表明，膽固醇分子嵌入脂雙層中的烴鏈之間，使得相轉(zhuǎn)換溫度變寬，膽固醇的剛性環(huán)結(jié)構(gòu)限制了液晶態(tài)脂酰鏈的運(yùn)動，因此能降低膜的流動性。而將膽固醇加入到處于凝膠相的脂中，可打亂伸展的脂酰鏈的有序組裝，從而增加膜的流動性。所以，動物細(xì)胞膜中膽固醇的存在有助于維持非常恒定的流動性14。一方面，當(dāng)磷脂分子與膽固醇分子作用時，膽固醇較小的親水極性基，能夠插入脂肪酸之間，并與之相互作用，這種相互作用降低了脂肪酸外層部分的流動性；此外，膽固醇分子的存在，能增加磷脂的填充密度。膽固醇和卵磷脂分子之間的這兩種相互作用削弱了磷脂分子的遷移率和流動性，使

19、得形成的S-BLMs變得更加致密，使得形成的S-BLMs的膜電阻增加，其穩(wěn)定性得到顯著提高。另一方面，卵磷脂分子的遷移率和流動性減小了，形成穩(wěn)定的S-BLMs所需要的時間明顯縮短，從而提高了S-BLMs的成膜效率。因此，在成膜液中加入膽固醇，不但可以使S-BLMs的膜電阻增加，還可以縮短形成穩(wěn)定的S-BLMs的成膜時間，可有效提高S-BLMs的成膜質(zhì)量和成膜效率。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽固醇較為合適的摻入質(zhì)量為卵磷脂的質(zhì)量的20%左右，如果膽固醇的摻入量過高，由于膽固醇分子可能形成二聚物，從而會減少弱其在成膜液中的作用。2.3成膜基底表面處理對S-BLMs穩(wěn)定性的影響除成膜液組成外，成膜基底(即金屬

20、支撐面)也對S-BLMs的性質(zhì)有重要的影響7。不同的金屬支撐物，S-BLMs支撐物端面的光潔程度，支撐物成膜部分面積的大小等因素都會影響到S-BLMs的穩(wěn)定性。一般來說，支撐物端面越平整，得到的S-BLMs的有序性和穩(wěn)定性應(yīng)該越好，所得的S-BLMs也就越接近真實(shí)的生物膜。目前研究較多的S-BLMs是在直徑為0.10.4 mm的金屬絲上形成的，當(dāng)金屬絲表面直徑大于0.4 mm時，常規(guī)方法所得的金屬端面非常不平整，因而較難形成穩(wěn)定的S-BLMs。為此，本文采取表面處理的方法，設(shè)法使橫截面積較大的不銹鋼絲端面變得平滑，從而為脂類分子在端面的有序自組裝排列提供了很好的平臺。圖4、圖5為經(jīng)過表面處理后

21、，直徑分別為 0.8 mm和1.0 mm 的不銹鋼絲支撐電極上S-BLMs的成膜過程的循環(huán)伏安曲線(掃描至曲線基本上不再變化為止)。圖4和圖5結(jié)果表明，掃描時間在1012 min 以內(nèi)時，雙層類脂膜的膜電阻和膜電容會發(fā)生較小的變化；而1520 min 以后，所得的循環(huán)伏安曲線基本不再發(fā)生大的變化，此時通過插入成膜液中的電極的電流比相應(yīng)的裸電極電流小24個數(shù)量級，這表明S-BLMs已經(jīng)穩(wěn)定形成。而實(shí)驗(yàn)表明，在未經(jīng)過表面處理的直徑0.8，1.0 mm 的不銹鋼絲電極上較難形成穩(wěn)定、完整的循環(huán)伏安曲線，由此可知，經(jīng)過端面處理，S-BLMs的成膜基底可以從0.1 0.4 mm的不銹鋼絲擴(kuò)展到0.8 1

22、.0 mm的不銹鋼絲上。不過，對比圖4和圖5可以看出，S-BLMs形成后，流過1.0 mm的不銹鋼絲上的電流要比流過0.8 mm的不銹鋼絲上的電流大得多(約2個數(shù)量級)，這表明1.0 mm的不銹鋼絲上形成的S-BLMs的膜電阻顯著減少。由于1.0 mm的不銹鋼絲上的面積較大，即使經(jīng)過表面處理，仍然難以獲得較為平整的端面，導(dǎo)致形成的S-BLMs中的分子排列不是非常整齊，S-BLMs的成膜質(zhì)量降低。由此可以說明，不銹鋼絲表面經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋砻嫣幚?，使表面變得較為平滑，卵磷脂雙層類脂膜在較大面積的不銹鋼絲表面也能夠穩(wěn)定存在，但不銹鋼絲直徑增加至1.0 mm后，會使得S-BLMs的成膜質(zhì)量明顯降低。電流

23、/ (10-8A)電壓 / V 圖4 0.8 mm不銹鋼絲表面處理后S-BLMs的循環(huán)伏安曲線Fig. 4 Cyclic voltammetric curves of the S-BLMs on the surface treated stainless steel (d=0.8 mm)電流 / (10-8A)電壓 / V 圖5 1.0 mm不銹鋼絲表面處理后S-BLMs的循環(huán)伏安曲線Fig. 5 Cyclic voltammetric curves of the S-BLMs on the surface treated stainless steel (d=1.0 mm)2.4成膜基底表面

24、處理后添加膽固醇對S-BLMs穩(wěn)定性的影響圖6a 為0.8 mm 的不銹鋼絲電極表面處理后添加膽固醇的卵磷脂膜循環(huán)伏安曲線。由圖可以看出，15 min 內(nèi)，該不銹鋼絲上可以獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線，這與圖4所得結(jié)果是一致的。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，若不添加膽固醇，當(dāng)掃描電壓范圍擴(kuò)大至-0.4 0.4 V時，難以獲得穩(wěn)定、完整的循環(huán)伏安曲線，這說明在該電壓掃描區(qū)間內(nèi)，0.8 mm不銹鋼絲表面上較難形成穩(wěn)定的卵磷脂雙層類脂膜。不過，與未添加膽固醇時的成膜液相比較，在表面處理后的直徑為0.8 mm 的不銹鋼絲電極上，增大掃描電位范圍至-0.4 0.4 V 時也能獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線，如圖6b所示。這表明，

25、同時采用電極表面處理和添加膽固醇的方法，不僅可以使得S-BLMs得以在較大直徑的不銹鋼絲金屬表面形成，而且可以擴(kuò)大掃描電位的范圍，這為進(jìn)一步研究模擬生物膜的功能，在較大的電位掃描范圍內(nèi)獲取有關(guān)生物膜電子傳遞、離子運(yùn)送、生物免疫和神經(jīng)傳導(dǎo)等方面的重要信息提供了便利。當(dāng)成膜基底直徑擴(kuò)大到1.0 mm 時，在掃描范圍較小的-0.2 0.2V 范圍內(nèi)，添加膽固醇的卵磷脂雙層類脂膜能夠形成穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。而在掃描電位范圍為-0.4 0.4 V 時，難以獲得比較穩(wěn)定的如循環(huán)伏安曲線，如圖7所示。這可能是由于金屬端面的不平整和掃描電位的增加所造成的。 電流 / (10-8A)電壓 / V 電流 / (1

26、0-8A)電壓 / V a b圖6 0.8 mm 的不銹鋼絲電極表面處理后添加膽固醇的S-BLMs的循環(huán)伏安曲線(掃描電壓分別為-0.40.4V(a)和-0.20.2V(b) Fig. 6 Cyclic voltammetric curves of the S-BLMs with the addition of cholesterol into the S-BLMs forming solution on the surface treated stainless steel (d=0.8 mm) with a scanning voltage of -0.40.4V(a) and -0.20

27、.2V(b)電流 / (10-8A)電壓 / V 圖7 1.0 mm 的不銹鋼絲電極表面處理后添加膽固醇的卵磷脂膜循環(huán)伏安曲線 Fig. 7 Cyclic voltammetric curves of the S-BLMs with the addition of cholesterol into the S-BLMs forming solution on the surface treated stainless steel (d=1.0 mm)3 結(jié)論利用卵磷脂的正癸烷溶液作為成膜液，在不銹鋼絲電極新生金屬端面上制備了S-BLMs。在成膜液中引入適量的膽固醇，可使卵磷脂分子在不銹鋼絲新生

28、端面上的排列更加緊密有序，從而提高S-BLMs的穩(wěn)定性和成膜效率；對成膜基底進(jìn)行表面處理，可有效擴(kuò)大能夠形成S-BLMs的不銹鋼絲的直徑。此外，同時采用添加膽固醇和不銹鋼絲電極表面處理的方法，可進(jìn)一步提高S-BLMs的穩(wěn)定性。該研究結(jié)果為提高S-BLMs的穩(wěn)定性提供了一種新的思路，同時也為S-BLMs的理論研究和實(shí)際應(yīng)用提供的有利條件。參考文獻(xiàn)1 Gu L, Wang L, Xun J, et al. HYPERLINK /science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TF7-3TKNHGF-N&_user=1002983&_coverDate=03%2F31%2F1996&_r

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