如何理解PacBio的準(zhǔn)確度

1、在這個例子中，來自于1的條的序列信息（相當(dāng)于的被用于介紹第三代測序中的單分子實(shí)時（）測序可以實(shí)現(xiàn)超過（5的咼度精確測序，且不受序列中和含量的影響，平均讀長可達(dá)（最長），這是如何實(shí)現(xiàn)的呢？這是因?yàn)榧夹g(shù)在與測序精確度相關(guān)的三個方面均有獨(dú)到之處：（一致性準(zhǔn)確性）（測序偏好性）（測序的表現(xiàn)）本文將從專業(yè)客觀的角度從這三方面詳細(xì)闡述測序技術(shù)的表現(xiàn)，圖文并茂，數(shù)據(jù)詳實(shí)，請各位看官留步，細(xì)細(xì)品味。（一致性準(zhǔn)確性）一個典型的測序過程通常包括三個基本步驟：（）生成測序，（）將生成的到已知的參考序列上，（）為了得到最終的序列而生成。如果樣本是未知起源的，那么第（）步就會被基因組組裝所代替，以便生成一個新的參考基因

2、組。最后一步是將原始測序至!J結(jié)果。為了使大家更好的理解測序技術(shù)是怎樣達(dá)到準(zhǔn)確度的，圖我們先來一下在系統(tǒng)中，測序結(jié)果是怎樣得到的。在這個例子中，一條的被到參考基因組上，紅色箭頭表示與參考基因組不一致的堿基。但是我們不能單憑這一條的結(jié)果就給出生物學(xué)結(jié)論，因?yàn)槲覀儾恢肋@種不一致究竟來自于真正的生物學(xué)變異還是僅僅是由于測序錯誤導(dǎo)致的。同樣，單憑一條也無法出，因?yàn)樵谶@種變異里，我們至少需要來自父方和母方染色體的各一條。因此，要想獲得真實(shí)準(zhǔn)確的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，必須通過將多條進(jìn)行，然后與參考基因組的相同區(qū)域進(jìn)行，換句話說，需要進(jìn)行為了判斷準(zhǔn)確度是否能達(dá)到或以上，需要把序列與已知的精準(zhǔn)判斷與參考位置究竟是，還

3、是，亦或是那么，同樣的策略其實(shí)也被用于測序技術(shù)中（見圖）。i.Generatesequenceread:匸Maptoreference：m.Generateconsensus(1Oxcoverage):WlrtwFi-gureObtainingsequencingreulhusngsecond-generationacqu&nargtechnol対i日乩SATJLLijCJi-AATSNP:SrP-TW*TTT9CIKAAT0#:L-芳cRtH77?綽9R4TAERaferBHcaUFigure2.ObiainingsequencingresultsusingSMRTSequencjrt.i,

4、Generatesequenceread:MGmnerateconsensus(10 xcoverage):測序可以產(chǎn)生更長的（平均讀長可達(dá),最長）k但是為了與圖1一致，便于理解，我們在圖2還是只看的長度。雖然在技術(shù)中，更容易出錯（平均錯誤率）%，這些錯誤主要由于（水平紅線）和（垂直紅線）引起?？紤]到的這些特征,公司開發(fā)了名為工具，專門為進(jìn)行了優(yōu)化。盡管單次讀?。┑腻e誤率稍高，但是使用還是可以準(zhǔn)確的將到參考序列的相應(yīng)位置。因此，正如圖中二代測序的例子一樣，無論哪種采用技術(shù)，沒有人會關(guān)注一個堿基只被測一次的結(jié)果，最終結(jié)果都是經(jīng)過分析之后得到的，比如，當(dāng)做到時候，每個位置的序列信息就是由10次讀取

5、之后產(chǎn)生的平均結(jié)果而定（如圖中垂直的框）。所以，對于三代測序來說，針對每一個堿基，次讀取中有次都是正確的，足夠讓我們判斷出該位置的正確信息。根據(jù)的這一特點(diǎn)，公司也開發(fā)了一個名為的工具，可以生成高質(zhì)量的序列然而，如果測序方法本身存在系統(tǒng)錯誤，無論之后的序列是不是正確,測序結(jié)果都將會受到影響。也就是說，如果某個堿基被系統(tǒng)地讀錯，那么在之后它也仍然是錯的，且這一錯誤是無法通過增加克服的。而測序技術(shù)的準(zhǔn)確率之所以能夠，最關(guān)鍵的一點(diǎn)就是由于的錯誤是隨機(jī)錯誤，這意味著隨著的增加，這種隨機(jī)錯誤可以很快被消減掉。這點(diǎn)已經(jīng)有多篇進(jìn)行了理論及實(shí)踐驗(yàn)證。圖說明了測序的準(zhǔn)確度與之間的關(guān)系，星號代表與達(dá)到一致。-A0P

6、誇g毋W與U與UEOQwithVie怕栢咖國一的參考序列相比較(例如已有金標(biāo)準(zhǔn)參考序列的物種)?？梢圆捎媚承┮驯粶y序廣泛測過的細(xì)菌基因組作為標(biāo)準(zhǔn)，如和。該圖表明了雖然的單次讀取的準(zhǔn)確性比其他方法略低，但是一旦增加，準(zhǔn)確率就可以快速提升，很多情況下可以實(shí)現(xiàn)完美的參考基因組。我們可以從看到，測序的準(zhǔn)確性甚至可以達(dá)到，也就是百萬個堿基里面只發(fā)生個堿基錯誤。生物通的準(zhǔn)確率可以超越其他測序方法，就是因?yàn)樗请S機(jī)錯誤。這也是很多研究都采用來驗(yàn)證基于其他平臺發(fā)現(xiàn)的的根本原因中高亮顯示的就是之后的準(zhǔn)確性。在該例中，對于任何測序平臺來說，有意義的也都是結(jié)果，而非單次讀取的結(jié)果。WWWLAPf0hHOC五譚pMl

7、MKrActiu；1”J*-f-IE-07pFBfKI441484Mt松1*fCM中IThlgl先的】吋t豐iiSf.UrvA現(xiàn)業(yè)W1-*i*J34V41；：X-W曲TMr已.U輛猝昶H-10|亠護(hù)軽Ng0凰MMMIIWuj4rjmetr*-4ftMiMqj1i：tMMpTrU:d訥*.証汀*ll&Mfl51*1-ffT-WifJimRh4221W*4HILIlT-曠j*.ITgHkR加致3*J*tJ*-j.|I.(1*七*JF112*1j*4俚“D血T倉11JH-|Mt*Pit*Jm%11rrMii1LH-tfT*iifKnpariItl-2J!rKhIPrfflu*3|flNkK対瑰i.H

8、E*flffI1AccmvcycxmprwanforMqurongCKmiMogtw(hsstcoiurir,PvcBo1wwnbiyicixncyinb&ti.ndtobkjmni11na454*MarawelMiy).FramKovni(201Genome1*：R101圖是關(guān)于驗(yàn)證的代表性的例子，直接用測序數(shù)據(jù)驗(yàn)證測序平臺產(chǎn)生的，清楚表明了測序準(zhǔn)確識別生物學(xué)變異的能力。(測序偏好性)以上的討論還僅僅限于那些容易被測到的序列。事實(shí)上，許多測序方法由于自身技術(shù)及原理的局限性，對于某些序列或者極端的堿基組成無能為力，所以對于這些區(qū)域，準(zhǔn)確率是。尤其對于極端或的，高度重復(fù)序列，長同型核苷酸延伸()

9、等區(qū)域，許多測序系統(tǒng)完全測不到或者測序質(zhì)量不好。同樣，回文序列在這些測序平臺中也無法被測到，因?yàn)榛匚男蛄性跇颖局苽涞臄U(kuò)增階段就已經(jīng)丟失了6基因組上這些區(qū)域往往缺乏，得到的測序結(jié)果不完整，導(dǎo)致基因組拼接時片段化嚴(yán)重，有時甚至?xí)G失掉以上的基因組，這無疑妨礙了全面鑒定序列以及對于完整基因組的構(gòu)建。Figjre4.ValidationofSftPsusingSMRTSequencing.FromPughelai.(2012)Nature4BB:1G6-110*.測序并不會表現(xiàn)出這種序列偏好性，在整個基因組的表現(xiàn)都非常穩(wěn)定，即PataJllurnlna便是那些被認(rèn)為非常難測的區(qū)域。這一優(yōu)勢可被用于那些

10、其他測序平臺上產(chǎn)生的。一個極端的例子可以用來證明測序的無偏好性，那就是對數(shù)千個堿基組成的含量區(qū)域的測序：三核苷酸的重復(fù)會導(dǎo)致綜合征（見圖）。同樣，因?yàn)榧夹g(shù)在樣本制備時無需擴(kuò)增，也不會收到回文序列的影響。y-a-*Bfigute5湖/忙l網(wǎng)theSMRT舸iOGHGC呻蟲柏口co時自刪FromlocmkiMl.(20U|Gcwn*AfC423121-iJ（測序的表現(xiàn)）即便測序得到的可以達(dá)到準(zhǔn)確，但是，如果它不能夠被準(zhǔn)確的到參考基因組上，我們?nèi)匀坏貌坏娇捎玫男畔ⅲ蛘哒f得到的是帶有誤導(dǎo)性質(zhì)的信息。這也就是為什么長度可以直接影響測序的準(zhǔn)確度。如果的長度不足以跨越基因組上含有至少一個特有的側(cè)翼序列的重

11、復(fù)區(qū)域，該的位置就不能被明確定義，因而，任何通過該得到的信息都是不明確的，也就是說無法準(zhǔn)確看出該到底在發(fā)生在基因組的哪個區(qū)域。這種不正確的會導(dǎo)致生物學(xué)變異的虛假分配（）。圖比較了和與人類基因組上一段重復(fù)區(qū)域的結(jié)果。圖中能看到系統(tǒng)錯誤對于的影響，的由于長度不夠，出現(xiàn)了很多錯誤匹配，從而造成假陽性。IPscBloRSRANDOMERRORFigufe6.Th白import白nc巳oflongreadlengthsfaraccuratemapprnginsequencing.AdaptedfromCarneiroetaL(2012)BMCGenomics13:375-3B32,Mismappedre

12、adssamegenomeregioncnbothdatictsSYSTEMATICERROR*41It十祈一FW1則可以避免這種錯誤匹配，因?yàn)槠渥x長長，長達(dá)上萬堿基的可以跨越基因組中重復(fù)區(qū)域并且把這些定位在基因組上正確的位置，從而糾正錯誤的分配。生物通結(jié)論正是由于技術(shù)具有以上三大特點(diǎn)：（）產(chǎn)生的是隨機(jī)誤差而非系統(tǒng)誤差；（）沒有序列的偏好性；（）具有足以跨越重復(fù)區(qū)域且避免錯誤匹配的長讀長。才能生成真正全面且高度精確的測序結(jié)果。生物通附錄：微小變異檢測對于那些關(guān)注同一樣本中低頻率（）存在的分子的應(yīng)用，確實(shí)是需要盡可能高的準(zhǔn)確率的，以便能進(jìn)行有效區(qū)分。對于這些應(yīng)用，也開發(fā)了一種測序模式，可以在分子

13、內(nèi)進(jìn)行，用這種方式產(chǎn)生的單分子測序的準(zhǔn)確率與相應(yīng)讀長下一代和二代測序的準(zhǔn)確率相當(dāng)，甚至是還要高。這是通過模板制備時生成的的環(huán)狀結(jié)構(gòu)達(dá)到的8這使得酶在同一個環(huán)上通過不斷繞圈，從而可以對同一個堿基進(jìn)行多次測序。生物通測序是目前唯一可以生成分子內(nèi)的技術(shù)，即便對于樣本中含量很低的分子，也可以得到高精確度的堿基序列。這一能力已經(jīng)被利用于檢測急性髓性白血病中的低頻突變。列出了上文提到的多分子和單分子模式分別適用的應(yīng)用方向。MuHI-MoleculeConsensusSngle-MaleculaConsensus林imb聞dt)novaRareva-fantdetection8ACtfefiovaassembly*Viralqfjasi-speciesGapcKJsng/scafloldingRareresislancsminatonsStnjctijrac-varialiandetectionRare,relatedtranscriptiscfonmsAmpliconseq