血庫實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和結(jié)果分析

1、血 庫 實(shí) 驗(yàn) 室 技 術(shù)和結(jié)果分析血庫實(shí)驗(yàn)室技術(shù) 一、實(shí)驗(yàn)操作的一般原則 二、常用紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù) 三、血清學(xué)檢測的注意事項(xiàng) 四、實(shí)驗(yàn)室工作的幾點(diǎn)體會一、實(shí)驗(yàn)操作的一般原則（一）.使用商品化試劑前，必須認(rèn)真閱讀試劑使用說明書；（二）.所有的實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)室所制定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，任何人員不得隨意更改步驟 ；（三）.實(shí)驗(yàn)所用的試管及玻片都應(yīng)清潔（最好不要重復(fù)使用），并且做好明確清楚的標(biāo)記；（四）.在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)先加血清，并檢查確認(rèn)每個試管，再加入細(xì)胞；一、實(shí)驗(yàn)操作的一般原則（五）.判讀結(jié)果時，應(yīng)該先判讀對照管，只有在對照管結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果時，才可進(jìn)一步判讀試驗(yàn)結(jié)果；（六）.判讀結(jié)果

2、時，要對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐一判斷，不要多個試管同時進(jìn)行；（七）.要完整記錄所有的試驗(yàn)現(xiàn)象，如抗體鑒定中的溶血；（八）.及時記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不要憑記憶補(bǔ)做記錄；一、實(shí)驗(yàn)操作的一般原則（九）.在記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果時注意陰、陽性的書寫，以避免書寫不清楚發(fā)生混淆，而導(dǎo)致的最終結(jié)果的錯報；建議對陽性結(jié)果用繁體字“陽”字記錄；陰性結(jié)果應(yīng)記錄“陰”或“O”；（十）.在正確完整的記錄了所有的結(jié)果后，才能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析說明 ；（十一）.在實(shí)驗(yàn)記錄單上應(yīng)標(biāo)明：試劑的廠家、批號、實(shí)驗(yàn)日期、室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果、實(shí)驗(yàn)操作者及復(fù)核者；一、實(shí)驗(yàn)操作的一般原則（十二）.實(shí)驗(yàn)全過程中應(yīng)避免樣本間的交叉污染；（十三）.操作過程中，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)

3、室生物安全的相關(guān)要求做好個人防護(hù)；（十四）.不合格標(biāo)本不能接受做血型定型和交叉配血試驗(yàn)。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)-凝集反應(yīng)1.凝集反應(yīng)定義 2.凝集反應(yīng)的兩個階段3.凝集反應(yīng)的特點(diǎn)1. 凝集反應(yīng)定義 細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞性抗原等顆粒性抗原，或可溶性抗

4、原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象?？乖乖懦饪乖贵w凝集反應(yīng)Y抗原抗原抗原YYYYYYYYYYYYYYYYY2.凝集反應(yīng)的兩個階段第一階段：抗原抗體的特異性結(jié)合；第二階段：出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。3.凝集反應(yīng)的特點(diǎn)Z電位：顆粒性抗原表面雙層離子云所形成的電位差?？乖贵w特異性互補(bǔ)結(jié)合時，抗體橋聯(lián)作用克服Z電位而使顆粒聚集在一起。IgM類抗體：完全抗體，分子量大，抗體橋聯(lián)作用足以克服Z電位，使顆粒聚集在一起； IgG類抗體：不完全抗體，分子量小，抗體橋聯(lián)作用不足以克服Z電位，顆粒不能聚集；3.凝集反應(yīng)的特

5、點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)時，為促使凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)，可采取以下措施： a.加電解質(zhì)或蛋白質(zhì)，降低離子強(qiáng)度縮短顆粒間的距離； b.加入右旋糖苷或葡聚糖，增加試驗(yàn)溶液的粘滯度； c.用胰酶或神經(jīng)氨酸酶處理，改變表面結(jié)構(gòu)； d.以離心方法克服顆粒間的排斥力等。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（二）標(biāo)本：1.血樣的采集

6、2.紅細(xì)胞懸液的配制3.標(biāo)本的保存1.血樣的采集.紅細(xì)胞標(biāo)本： 作為抗原的紅細(xì)胞標(biāo)本，可用末梢血，直接用生理鹽水配制成懸液；在多數(shù)情況下是靜脈采血，用ACD或CPD血液保存液抗凝，或乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）抗凝，血液與保存液之比為4:1，每毫升血用5%的Na2。用于抗球蛋白試驗(yàn)的紅細(xì)胞標(biāo)本要抗凝，原因?yàn)椋翰豢鼓龢?biāo)本在溫度較低的情況下，自身冷抗體會與紅細(xì)胞作用，活化補(bǔ)體，使紅細(xì)胞上結(jié)合有C3b和C4b，造成抗球蛋白試驗(yàn)的假陽性。1.血樣的采集 .血清標(biāo)本：取靜脈血慢慢注入干燥管內(nèi)，置37恒溫箱，待凝固后用玻璃棒攪動血塊，使之與管壁剝離，然后置4 過夜、離心分離血清。必要時血液凝固后即

7、離心分離血清，但分出的血清較少，同時也沒有4 過夜吸收冷自身抗體的作用。 需要補(bǔ)體參與的血清學(xué)試驗(yàn)，要用新鮮血清，或添加新鮮AB型血清作為補(bǔ)體來源；而有些試驗(yàn)用的血清或做試劑用的血清則要經(jīng)56 30min滅活補(bǔ)體后使用。 一般試驗(yàn)避免使用血漿，防止纖維蛋白原的干擾。 2.紅細(xì)胞懸液的配制.用于血型鑒定、交叉配血的紅細(xì)胞至少要用大量的生理鹽水洗一遍，通過洗滌可以去除吸附在紅細(xì)胞表面的血型物質(zhì)、血漿蛋白質(zhì)、抗凝劑等成分。.配制懸液時應(yīng)將最后一次洗滌的紅細(xì)胞 3000轉(zhuǎn)/分 離心30分鐘壓積，在不去除上層鹽水的情況下，吸取一定量的壓積細(xì)胞按體積百分比配制成所需要濃度的懸液。 一般洗滌壓積的紅細(xì)胞1滴

8、，加8滴生理鹽水，配制成的濃度為10%的細(xì)胞懸液。10%的懸液：測定抗體親和力； 2%的懸液：滴定抗體效價； 5%的懸液：常用于血型鑒定或間抗試驗(yàn)。3.標(biāo)本的保存血清標(biāo)本： 不稀釋的血清標(biāo)本如加防腐劑（10%的疊氮鈉防腐，最終濃度為0.1%）可在4保存數(shù)月，但要防止干涸；如在-20 可保存數(shù)年，抗體活性基本不變。紅細(xì)胞標(biāo)本:一般試驗(yàn)用的凝血標(biāo)本要在5天之內(nèi)使用，以不溶血為準(zhǔn)。如用ACD或CPD血液保存液可保存3周，各種保存的紅細(xì)胞在使用之前都要用生理鹽水洗滌一遍。在操作的每一環(huán)節(jié)中所用的鹽水盡可能使用注射用生理鹽水，在高溫環(huán)境里的使用間歇，鹽水也應(yīng)置4 貯存，防止長菌。 生理鹽水稀釋的血清只限

9、當(dāng)天使用。 用作交叉配血的供、受者標(biāo)本要在4保存一周，以便在出現(xiàn)輸血反應(yīng)時可備查用。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)1.概述2.方法3.離心的要求4.試驗(yàn)記錄5.緡錢狀凝集的處理 1.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)概述 鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)中的抗原是用鹽水作為介質(zhì)的紅細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞上的抗

10、原決定簇與相應(yīng)的抗體分子特異性結(jié)合，紅細(xì)胞交叉聯(lián)接形成肉眼可見的凝集反應(yīng)。鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)用于IgM抗體的檢出與鑒定、鹽水配血試驗(yàn)，以及某些血型系統(tǒng)的血型鑒定，如ABO、MN、P等。 在鹽水介質(zhì)中，凝集是IgM抗體的行為，但在ABO血型系統(tǒng)中，A、B抗原位點(diǎn)多，當(dāng)IgG抗A、抗B的濃度足夠大時，在鹽水介質(zhì)中也能發(fā)生凝集。2.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)的方法 平板法：有玻璃片、陶瓷板、搪瓷板、塑料板、以及防剩漏的血型紙等多種質(zhì)地的平板可供選用，現(xiàn)在多用的帶凹的專用板，操作方便。操作時在平板上做好標(biāo)記，加一滴待檢血清或試劑血清，再加紅細(xì)胞鹽水懸液1滴，混勻后放置于室溫，并不時轉(zhuǎn)動反應(yīng)板，以加速反應(yīng)的發(fā)生。反

11、應(yīng)快的在混勻后數(shù)秒即出現(xiàn)凝集，最遲在15分鐘內(nèi)肉眼觀察結(jié)果，亦可用低倍鏡觀察。2.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)的方法 試管法：為推薦方法。根據(jù)需要取小試管一支或數(shù)支，做好標(biāo)記，每管加血清2滴，再加所需濃度的相應(yīng)紅細(xì)胞懸液1滴，然后根據(jù)抗體的性質(zhì)置于37，或18-22，或4作用一小時，觀察結(jié)果。常用的臺式小離心機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分 離心 1min觀察后結(jié)果。2.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)的方法 在鹽水凝集試驗(yàn)，一般設(shè)兩個對照：一個是有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞與抗體反應(yīng)作為陽性對照；另一個是不帶抗原的紅細(xì)胞與血清反應(yīng)作為陰性對照。只有對照管的結(jié)果正確，試驗(yàn)結(jié)果才可靠。3.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)中離心的要求 在鹽水法測定血型和交叉配血時

12、，多采用立即離心法。正確操作應(yīng)該是將紅細(xì)胞懸液加到血清后立刻離心。對于ABO血型系統(tǒng)，如果在室溫放置2分鐘后離心，可能使3+-4+的凝集減弱為0（-）-1+，并有明顯或不明顯的溶血。如果在室溫放置5分鐘后離心，原來有的凝集可能消失，并有溶血。還有些標(biāo)本在延遲離心后，本應(yīng)有的凝集會變?yōu)榧炔荒植蝗苎蚨l(fā)現(xiàn)不了ABO血型的不配合，這種情況多發(fā)生在O型血清與其他型的紅細(xì)胞試驗(yàn)中，發(fā)生率在2%-3%左右。4.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)記錄判讀結(jié)果前應(yīng)預(yù)先設(shè)計(jì)好記錄冊，在記錄冊上標(biāo)記好細(xì)胞樣本和血清樣本的位置，一邊觀察，一邊記錄結(jié)果。常用的記錄符號及所示的凝集強(qiáng)度如下： 4+：一個大凝塊，背景透明，無游

13、離細(xì)胞； 3+：數(shù)個大凝集塊，背景透明，無游離細(xì)胞； 2+：許多小凝集塊，肉眼可見，大小均勻，背景基本透明，有游離細(xì)胞。 1+：很小的凝集塊，肉眼還可見，背景不透明，游離細(xì)胞較多，常要用顯微鏡觀察。 0（-）：無凝集，無溶血，全是游離細(xì)胞，要用顯微鏡觀察。 pH:部分溶血。 H：完全溶血。5.鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)中緡錢狀凝集的處理緡錢狀凝集，也稱錢串狀凝集，是一種紅細(xì)胞的假性凝集，一般紅細(xì)胞在自身血漿中沉降時可以看到緡錢狀的形成。在血漿球蛋白異常時，如高球蛋白血癥、巨球蛋白血癥時會出現(xiàn)緡錢狀；另外在患者使用大分子右旋糖酐和羥乙基淀粉溶液作為血容量擴(kuò)張劑時也可產(chǎn)生緡錢狀凝集。實(shí)驗(yàn)中遇到緡錢狀凝集時，

14、可將血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)；在顯微鏡下觀察到緡錢狀凝集時加一滴生理鹽水通常就可以消除。緡錢狀凝集一般不影響間抗試驗(yàn)，嚴(yán)重的可在37孵育前加1-2滴生理鹽水，孵育過程中搖動數(shù)次。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)1.原理2.常用的膠體介質(zhì)3.方法二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查1.膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)原理

15、IgG抗體在鹽水介質(zhì)里通常不發(fā)生凝集，但如果用膠體介質(zhì)配制紅細(xì)胞懸液，膠體介質(zhì)縮短了紅細(xì)胞間的距離，當(dāng)紅細(xì)胞上的抗原與遇到血清中與它相對應(yīng)的IgG抗體，二者發(fā)生特異性結(jié)合，并出現(xiàn)肉眼能觀察到的凝集現(xiàn)象。2.膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)常用的介質(zhì) 用以構(gòu)成膠體介質(zhì)的物質(zhì)有：牛血清白蛋白，人白蛋白，AB型血清，受檢者本人血清，阿拉伯樹膠等。其中以AB型血清取材方便，牛白蛋白效果好，使用較多。人AB型血清：無額外抗體、含A，B血型物質(zhì)少、促進(jìn)凝集強(qiáng)的可備用。牛白蛋白：商品化、常用22%的濃度（促凝效果最好）、30%的濃度（有利于檢出部分弱的Rh抗體）、7%的濃度（有利于IgG 抗-A和抗-B的檢出）。3.膠體介

16、質(zhì)凝集試驗(yàn)的方法 膠體介質(zhì)配血法：在兩支小試管中分別加供者和受者的5%鹽水紅細(xì)胞懸液1滴，然后加適量的生理鹽水，混勻，離心去上清，瀝干。再分別加受者和供者的血清兩滴，混勻，立即離心，輕輕搖動觀察結(jié)果，如有凝集或溶血，表示不配合，不必進(jìn)行下面的試驗(yàn)，如沒有凝集或溶血，再各加兩滴AB型血清或牛白蛋白溶液，37孵育一小時，讀取結(jié)果。也可孵育15-30分鐘轉(zhuǎn)入抗球蛋白試驗(yàn)。 白蛋白鋪層法：是一種比較簡單實(shí)用的方法。操作時在做好標(biāo)記的試管內(nèi)加2-3滴血清，在加5%鹽水紅細(xì)胞懸液1滴，混勻，置37孵育15-30分鐘。3400轉(zhuǎn)/分 離心15秒，不要搖動紅細(xì)胞扣。然后沿管壁加2滴牛白蛋白溶液，使其在紅細(xì)胞扣

17、上形成一薄層，不要混合，置37孵育5-10分鐘，輕輕搖動，讀取結(jié)果。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)1.原理2.常用的酶3.方法4.關(guān)于酶處理紅細(xì)胞凝集素1.酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)原理 紅細(xì)胞表面有豐富的唾液酸，在中性環(huán)境里紅細(xì)胞帶負(fù)電荷，所以紅細(xì)胞之間是相互排斥的。蛋

18、白水解酶能消化破壞這種唾液酸，減少紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，從而使紅細(xì)胞距離縮短，IgG內(nèi)抗體分子就能與有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集。酶法能顯著增強(qiáng)Rh和Kidd系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)，但同時會破壞M、N、S、s、Fya和 Fyb抗原，對它們不能用酶處理的方法。2.酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)常用的酶.常用的酶有菠蘿酶、木瓜酶、胰酶、無花果酶等。.酶的配制和保存：配制略。保存-20可以保存2個月。用前融化，當(dāng)日用不完必須棄去。在配制酶溶液時要注意個人防護(hù)。另外，各種酶粉都容易潮解，要注意密封保存。3.酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)的方法.一期法酶試驗(yàn)。.二期法酶試驗(yàn)。4.酶處理細(xì)胞凝集素 酶處理細(xì)胞凝集素：是指有一些抗體能

19、與胰酶、木瓜酶、菠蘿酶等酶處理的細(xì)胞發(fā)生凝集，但不與未處理的細(xì)胞反應(yīng)，原因可能是酶處理后某些抗原位點(diǎn)得以暴露，且不同酶暴露的位點(diǎn)不完全相同，把這類能與酶處理后的紅細(xì)胞發(fā)生凝集的抗體可稱為酶處理細(xì)胞凝集素。通常不引起輸血反應(yīng)。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（六）抗球蛋白試驗(yàn)1.原理2.抗球蛋白

20、試劑3.方法4.試劑對照細(xì)胞的制備5.增強(qiáng)抗球蛋白試驗(yàn)的方法6.結(jié)果分析7.臨床應(yīng)用1.抗球蛋白試驗(yàn)原理 抗球蛋白試驗(yàn)又稱Coombs試驗(yàn)，原理為：紅細(xì)胞表面包被了IgG抗體分子，或補(bǔ)體分子C3、C4的片段，但不能出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。IgG抗體和補(bǔ)體都是人球蛋白，用它們免疫動物，或者通過雜交瘤技術(shù)可以得到抗球蛋白，這類抗球蛋白的特異性針對IgG分子的FC段或補(bǔ)體C3、C4的片段，可以和包被在紅細(xì)胞上的IgG抗體和補(bǔ)體作用，從而起到搭橋的作用，使紅細(xì)胞發(fā)生凝集?？骨虻鞍自囼?yàn)又稱Coombs試驗(yàn)抗球蛋白試驗(yàn)2.抗球蛋白試劑多特異性抗球蛋白試劑：曾稱為廣譜抗球蛋白試劑，試劑中應(yīng)含有抗-IgG和抗-C3d。

21、一般用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體比較純一。它主要用于配血試驗(yàn)和直接抗球蛋白試驗(yàn)，尤其適用于自身免疫性溶血性貧血的直接抗球蛋白試驗(yàn)。單特異性抗球蛋白試劑：主要為抗-IgG和抗-C3d兩種。其中抗-IgG用于配血試驗(yàn)，及抗體的檢出和鑒定；對溫抗體型的自身免疫性溶血性貧血的患者，一般先用多特異性抗球蛋白試劑做直接抗球蛋白試驗(yàn)，如出現(xiàn)陽性，再用抗-IgG和抗-C3d來分型。另外，冷凝集素病是由IgM引起的，但包被的在紅細(xì)胞上的IgM在洗滌過程中容易解離，留在紅細(xì)胞上的主要為補(bǔ)體片段，所以冷抗體引起的自身免疫性溶血性貧血一般是補(bǔ)體型的。3.抗球蛋白試驗(yàn)方法直接抗球蛋白試驗(yàn)間接抗球蛋白試驗(yàn)（1）直接Coo

22、mbs試驗(yàn)不完全抗體檢測紅細(xì)胞上抗體（2）間接Coombs試驗(yàn)檢測血清中的抗紅細(xì)胞抗體4.抗球蛋白試驗(yàn)試劑對照細(xì)胞的制備 在直抗和間抗試驗(yàn)中，陰性結(jié)果都要用試劑對照細(xì)胞檢查，也就是要用IgG和補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞去驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.抗球蛋白試驗(yàn)試劑對照細(xì)胞的制備 IgG致敏的紅細(xì)胞的制備 37 、15-30minO型Rh（+）cell+IgG抗-D 配成5%的懸液備用 3次以上鹽水洗滌 4.抗球蛋白試驗(yàn)試劑對照細(xì)胞的制備 補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞的制備 置20ml10%的蔗糖溶液于一只大試管中，加4-6滴新鮮血液，或加2滴洗滌過的壓積紅細(xì)胞和4滴AB型新鮮血清，孵育 37 、15-30min；用生

23、理鹽水洗滌3次以上配制成3%的細(xì)胞懸液備用。（4 可保存48小時） 5.增強(qiáng)抗球蛋白試驗(yàn)的方法酶法：對某些Rh、Lewis、Kidd系統(tǒng)抗體的反應(yīng)有明顯增強(qiáng)作用。低離子介質(zhì)法：紅細(xì)胞用低離子強(qiáng)度的溶液配制成的懸液做間抗試驗(yàn)，可縮短致敏時間15min。牛白蛋白法：在間抗試驗(yàn)的試管中加2滴30%的牛白蛋白溶液，可縮短致敏時間15min。聚乙二醇法：在間抗試驗(yàn)的試管中加4滴10%分子量為4000的聚乙二醇(PEG)溶液，可縮短致敏時間15min。6. 抗球蛋白試驗(yàn)的結(jié)果分析陽性對照管凝集，陰性對照管不凝集，受檢管凝集者為陽性，不凝集者應(yīng)再進(jìn)一步加入試劑對照細(xì)胞，如果凝集為則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。如陽性或陰

24、性對照出現(xiàn)不規(guī)則結(jié)果應(yīng)分析原因，重新試驗(yàn)。6. 抗球蛋白試驗(yàn)的結(jié)果分析注意事項(xiàng)：離心過度，紅細(xì)胞不易散開，可導(dǎo)致假陽性。紅細(xì)胞在鹽水洗滌時已有凝集，可導(dǎo)致假陽性。紅細(xì)胞洗滌時應(yīng)迅速、連續(xù)，不應(yīng)中途停止。標(biāo)本采集后立即進(jìn)行試驗(yàn)，延遲試驗(yàn)或中途停止試驗(yàn)，可使抗體從細(xì)胞上丟失（直抗）?？骨虻鞍籽鍑?yán)格按照操作說明書使用，否則可產(chǎn)生前帶或后帶反應(yīng)，導(dǎo)致假陰性。6. 抗球蛋白試驗(yàn)的結(jié)果分析注意事項(xiàng)：紅細(xì)胞上吸附抗體太少，或Coombs陰性自身免疫性溶血性貧血直抗試驗(yàn)可呈假陰性反應(yīng)。全凝集或冷凝集血標(biāo)本及臍帶血標(biāo)本含有Wharton膠、洗滌不充分，血標(biāo)本中有很多網(wǎng)織紅細(xì)胞，以及抗球蛋白血清中含有抗運(yùn)鐵蛋白

25、時，都可使紅細(xì)胞凝集，出現(xiàn)假陽性。陰性結(jié)果應(yīng)核實(shí)：在試管中再加一滴IgG致敏紅細(xì)胞，如陽性則表示試管內(nèi)的抗球蛋白血清確未被消耗。7.抗球蛋白實(shí)驗(yàn)的臨床應(yīng)用新生兒溶血?。℉DN）：胎兒紅細(xì)胞已被母親血型抗體致敏時。自身免疫性溶血性貧血（AIHI）：自身抗體吸附自身紅細(xì)胞時。溶血性輸血反應(yīng)：輸入紅細(xì)胞被受者不完全抗體致敏時。藥物性貧血：甲基多巴類藥物、青霉素等產(chǎn)生的不完全抗體吸附于紅細(xì)胞時。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（

26、十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查(七).微柱凝膠試驗(yàn)原理: 凝膠具有分子篩效應(yīng)和親和效應(yīng)，在微柱凝膠介質(zhì)中紅細(xì)胞抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，利用凝膠的空間位阻經(jīng)低速離心，凝集的紅細(xì)胞懸浮在凝膠的上層，而未和抗體結(jié)合的紅細(xì)胞則沉于凝膠的底部（管底尖部）。微柱凝膠試驗(yàn)原理 將紅細(xì)胞和抗血清加在凝膠上部反應(yīng)，離心后觀察凝集的紅細(xì)胞，被阻擋在小柱中凝膠的上部或中央，證明發(fā)生凝集反應(yīng)，判斷凝集反應(yīng)陽性,游離的紅細(xì)胞，被擠過裝有過濾介質(zhì)的小柱，而到達(dá)小柱的底部，證明未發(fā)生凝集判斷陰性. 二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)

27、（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查（八）.聚凝胺的運(yùn)用原理： Poly是一種帶高價陽離子的多聚物，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可中和紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞之間距離減少，能引起正常紅細(xì)胞可逆性的非特異性凝聚。而當(dāng)血清中含有IgG抗體與紅細(xì)胞上相應(yīng)得抗原結(jié)合在聚凝胺的作用下發(fā)生凝集，凝聚和凝集在表面上是不能區(qū)分的，再加枸櫞酸鈉重懸液，枸櫞酸根的負(fù)電荷與聚凝胺正電荷中和，重懸后凝

28、聚現(xiàn)象消失，而真正的凝集是不會消失的。1 紅細(xì)胞間有一定間距2 加入聚凝胺后，可以縮短紅細(xì)胞之間的距離，使其非特異性凝集3 加入枸櫞酸鈉，可以中和聚凝胺4 紅細(xì)胞的非特異性凝集消失聚凝胺原理示意圖1聚凝胺枸櫞酸鈉1 紅細(xì)胞上已有不完全抗體致敏2 加入聚凝胺后，縮短紅細(xì)胞之間的距離，讓不完全抗體可以同時與兩個紅細(xì)胞結(jié)合使其特異性凝集3 加入枸櫞酸鈉中和聚凝胺4 由于不完全抗體的結(jié)合，紅細(xì)胞的特異性凝集不消失聚凝胺原理示意圖2聚凝胺枸櫞酸鈉不完全抗體二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白

29、試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查（九）.抗體效價滴定1. 原理2.方法與IgG抗體的區(qū)分1.抗體效價滴定原理 將血清經(jīng)連續(xù)倍比稀釋后與選定的紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，通常以肉眼觀察到的最后一個“+”的凝集管作為判斷的終點(diǎn)，終點(diǎn)血清稀釋度的倒數(shù)為效價或滴度。 2.抗體效價滴定方法 取小試管若干，依次編號。每管加鹽水（或）ml準(zhǔn)確吸取等量血清加入第1管，充分混勻，即為1:2血清稀釋液。然后從第1管吸?。ɑ颍﹎l，加入第2管，充分混勻后再吸?。ɑ颍﹎l加入第3管，依次稀釋到第n管，

30、稀釋度為1:2n。與IgG抗體的區(qū)分 在有些血清里同一特異性的抗體有IgM也有IgG，如抗-A、抗-B、抗-M、抗-E等。區(qū)分IgM和IgG并測IgG的效價，有一定實(shí)用意義，特別是對新生兒溶血病的免疫學(xué)檢測是必不可少的。在鹽水介質(zhì)中凝集是IgM抗體的性質(zhì)，要檢出IgG抗體必須將IgM抗體破壞，常用的方法是巰基試劑處理法。 常用試劑為：2-巰基乙醇（2-ME）應(yīng)用液。巰基試劑區(qū)分IgM與IgG的原理待檢血清2-ME(巰基乙醇)IgM抗體分子裂解IgG抗體分子不被滅活保持血清學(xué)特性(致敏相應(yīng)紅細(xì)胞)IgA抗體分子部分滅活失去與相應(yīng)紅細(xì)胞凝集的作用二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)

31、基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查（十）.吸收、放散試驗(yàn)1.吸收試驗(yàn):抗原與抗體的結(jié)合是特異性的，因此具有抗體活性的血清加入相應(yīng)抗原后，抗體的活性下降或消失，這種作用稱為吸收試驗(yàn)。2.放散試驗(yàn)是抗原與抗體的結(jié)合是可逆的，在物理?xiàng)l件改變時，抗體又會從抗原抗體復(fù)合物上分離下來，將抗體由抗原抗體復(fù)合物上分離下來的試驗(yàn)稱為放散試驗(yàn)。二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免

32、疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查（十一）.凝集抑制試驗(yàn) 概述：抗體能與有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞發(fā)生特異性凝集，體液中的可溶性抗原物質(zhì)能與該抗體發(fā)生特異的中和，抑制了抗體凝集紅細(xì)胞的作用。用這種可溶性物質(zhì)來抑制抗體與紅細(xì)胞凝集的試驗(yàn)，稱為凝集抑制試驗(yàn)。常用于ABH或Lewis分泌狀態(tài)的檢查，幫助ABO亞型的確認(rèn)以及特殊情況下（紅細(xì)胞標(biāo)本完全溶血） ABO血型的鑒定。二、常用

33、的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八）聚凝胺的運(yùn)用（九）抗體效價滴定（十）吸收放散試驗(yàn)（十一）凝集抑制試驗(yàn)（十二）新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查（十三）免疫性溶血病輸血反應(yīng)的調(diào)查（十二）.新生兒溶血病的免疫學(xué)檢查1.發(fā)病機(jī)理2.標(biāo)本的要求3.母嬰標(biāo)本的ABO血型檢測4.新生兒標(biāo)本的檢查5.母親標(biāo)本的檢查1.新生兒溶血病發(fā)病機(jī)理 新生兒溶血病起源于胎兒從父親方面繼承了一些母親沒有的紅細(xì)胞抗原，使得母嬰血型不合，母體存在與胎兒RBC血型抗原相應(yīng)的免疫性抗體（IgG類），此免

34、疫性抗體可以通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，并包被在胎兒RBC上，在分娩前后加速胎兒RBC破壞發(fā)生溶血，造成胎兒發(fā)生以溶血為主要損害的一種被動免疫性疾病。1.新生兒溶血病發(fā)病機(jī)理 無論是哪種血型系統(tǒng)不合，必須具備以下兩條才能引起新生兒溶血?。℉DN）： 1.母親血漿中必須有與胎兒不相合的抗體； 2.此種抗體能通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)。 1.新生兒溶血病發(fā)病機(jī)理 國內(nèi)常見的血型不合引起的新生兒溶血為ABO及Rh血型不合，其中以ABO不合者居多，Rh不合者次之。ABO-HDN一般母親均為O型，嬰兒為A或B型（以A型較多），多發(fā)生在第一胎。Rh-HDN一般母親多為Rh-、子代為Rh+，多發(fā)生于第二胎，發(fā)病較重。如孕婦曾有輸血史或流產(chǎn)史，也可發(fā)生在第一胎。2.標(biāo)本的要求一般要求新生兒標(biāo)本為不抗凝血；母親標(biāo)本為抗凝血。標(biāo)本量4-5ml。3.母嬰標(biāo)本的血型檢測 取母嬰的洗滌紅細(xì)胞、血清（血漿）按常規(guī)方法做ABO、Rh血型鑒定。4.新生兒標(biāo)本的檢查新生兒溶血病患兒標(biāo)本須做下面三項(xiàng)試驗(yàn)：直接抗球蛋白試驗(yàn)游離IgG抗體測定放散試驗(yàn)5.母親標(biāo)本的檢查IgG抗-A、抗-B效價的測定ABO意外抗體的檢查有關(guān)血型抗原的檢查二、常用的紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù)（一）紅細(xì)胞血清學(xué)的免疫學(xué)基礎(chǔ)（二）標(biāo)本（三）鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（四）膠體介質(zhì)凝集試驗(yàn)（五）酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)（六）抗球蛋白試驗(yàn)（七）微柱凝膠試驗(yàn)（八