醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-2蛋白質(zhì)的修飾與降解課件

1、第二部分 蛋白質(zhì)的修飾與降解在完成肽鏈合成和折疊形成正確的空間構(gòu)象后，許多蛋白質(zhì)還需要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，才能發(fā)揮正常的功能。蛋白質(zhì)修飾和降解在真核細(xì)胞生長(zhǎng)和平衡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究意義原核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)高爾基體線粒體滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶酶體核糖體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞核蛋白質(zhì)的修飾概念：是指蛋白質(zhì)翻譯后進(jìn)行共價(jià)修飾加工的過(guò)程，通過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。目的：調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更完善。蛋白質(zhì)的修飾磷酸化修飾脂基化修飾甲基化修飾乙?；揎楊惙核鼗揎棸投辊；揎椧?、磷酸化修飾蛋白激酶催化的磷酸基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是最常見，最重要的蛋白質(zhì)翻譯

2、后修飾方式之一。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。1992年 Fischer EH和krebs EG 共同獲諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化：是通過(guò)蛋白激酶催化將ATP或GTP的位磷酸基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)上的過(guò)程。蛋白質(zhì)去磷酸化：蛋白質(zhì)磷酸化逆過(guò)程由蛋白磷酸酶催化，稱為蛋白質(zhì)去磷酸化。細(xì)胞內(nèi)30%蛋白質(zhì)可被磷酸化和去磷酸化修飾。蛋白質(zhì)磷酸化的生物學(xué)作用 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、 神經(jīng)活動(dòng)、 肌肉收縮及細(xì)胞增殖、 發(fā)育和分化等生理病理過(guò)程。許多調(diào)控機(jī)制都涉及蛋白質(zhì)的磷酸化修飾。蛋白質(zhì)磷酸化修飾生物學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)或減弱被修飾蛋白質(zhì)的酶活性或其他活性；改變蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；改變蛋白質(zhì)與其他

3、蛋白質(zhì)或其他生物分子的相互作用。催化蛋白質(zhì)磷酸化的蛋白激酶 最大的蛋白家族，有保守的催化核心（250-300個(gè)氨基酸殘基）和多種調(diào)控模式。 根據(jù)底物的磷酸化位點(diǎn)分為三類：蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸激酶；蛋白質(zhì)酪氨酸激酶；雙專一性蛋白激酶1.蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸激酶cAMP依賴的蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase, PKA)Ca2+/磷脂依賴的蛋白激酶（Ca2+ /phospholipid dependent protein kinase, Ca2+ /PL-PK)或蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶（Ca2+

4、/calmodulin dependent protein kinaes, CaM-PK)cGMP依賴的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase, PKG)DNA依賴的蛋白激酶（DNA dependent protein kinase, DNA-PK)2.蛋白質(zhì)酪氨酸激酶特異性催化蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化的激酶家族。分為受體型PTK和非受體型 PTK。3.雙專一性蛋白激酶同時(shí)自身磷酸化Tyr和Ser/Thr在信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中其重要作用催化蛋白質(zhì)去磷酸化的蛋白磷酸酶蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶 PP1、PP2A、PP2C、PPX等，亞細(xì)胞定位不同。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶 目前

5、已發(fā)現(xiàn)30多種，1/3是跨膜蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，類似受體分子。2/3位于胞質(zhì)，為非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶。蛋白激酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性均可被一些小分子化合物抑制。這些小分子化合物在疾病治療或蛋白激酶和蛋白磷酸酶的研究中具有重要的意義。1.常見的蛋白酶抑制劑作用于蛋白激酶ATP結(jié)合部位抑制劑： 該類抑制劑對(duì)PKA、PKC、PKG、MLCK、CK 、CK、CAMK均有抑制作用。 是應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑。PTK的抑制劑2.常見的蛋白磷酸酶抑制劑PP1和PP2A的抑制劑： 主要抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性。作用于PP2B的抑制劑： 抑制Ca2+

6、依賴蛋白磷酸酶的活性二、脂基化修飾脂基化蛋白是一類膜蛋白，其特定的脂肪鏈修飾可幫助這類蛋白質(zhì)細(xì)胞膜上定位，協(xié)助該蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。蛋白質(zhì)脂基化：長(zhǎng)鏈脂肪酸通過(guò)O或者S原子與蛋白質(zhì)形成蛋白綴合物的過(guò)程，通常是蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基被棕櫚?；?，或者被法呢基化修飾。蛋白質(zhì)脂基化的生物學(xué)作用脂基化蛋白相當(dāng)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)脂基化增強(qiáng)蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的親和性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、 蛋白質(zhì)之間的相互作用及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。催化蛋白質(zhì)脂基化的酶棕櫚?；D(zhuǎn)移酶 該酶抑制劑具有抗腫瘤特性法呢基轉(zhuǎn)移酶 該酶抑制劑對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用。三、甲

7、基化（protein methylation)修飾 概念：在甲基化轉(zhuǎn)移酶催化下，甲基基團(tuán)由甲基S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至相應(yīng)蛋白質(zhì)的過(guò)程。 甲基代替了氨基上的H原子，減少了氫鍵的形成數(shù)量，甲基增加了空間阻力，影響底物與蛋白質(zhì)的相互作用。 蛋白質(zhì)甲基化修飾的生物學(xué)作用影響蛋白質(zhì)之間的相互作用蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用蛋白質(zhì)的定位RNA加工細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 如：組蛋白甲基化影響異染色質(zhì)形成、 基因印記和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。催化蛋白質(zhì)甲基化的酶催化蛋白質(zhì)甲基化的酶是甲基轉(zhuǎn)移酶；蛋白質(zhì)主要在賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈氨基上進(jìn)行甲基化。也有在天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈羧基上進(jìn)行甲基化。四、乙?；?protein acetylatio

8、n）修飾 概念： 是指在乙酰基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在蛋白質(zhì)特定位置上添加乙酰基的過(guò)程。 蛋白質(zhì)乙?；纳飳W(xué)作用組蛋白乙?；{(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄可實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控調(diào)節(jié)代謝酶的活性及代謝通路催化蛋白質(zhì)乙?；拿?催化蛋白質(zhì)賴氨酸乙?；且阴；D(zhuǎn)移酶。五、類泛素化修飾小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin related modifier, SUMO)是類泛素家族重要成員；SUMO分子結(jié)構(gòu)與SUMO化反應(yīng)途徑與泛素類似，但功能不同；SUMO化修飾參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核轉(zhuǎn)運(yùn)、維持基因組完整性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。SUMO的結(jié)構(gòu)與泛素相同：一個(gè)-折疊纏繞一個(gè)-螺旋球形折疊，C-端兩個(gè)Gly殘基。與泛素區(qū)別：N

9、-端有10-25個(gè)氨基酸的延伸，表面電荷不同。SUMO的分類分布廣泛，人類有四種： SUMO1、SUMO2 、 SUMO3、 SUMO4SUMO1-3：在各個(gè)組織均表達(dá)SUMO4:在腎臟、淋巴結(jié)和脾臟表達(dá)催化蛋白質(zhì)SUMO化修飾的酶 SUMO化修飾需要多個(gè)酶參與： E1活化酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶。SUMO化修飾中，E1和E2可使底物蛋白完成修飾。但大多數(shù)SUMO化修飾仍需要E3連接酶的參與。E3連接酶并不與SUMO分子形成共價(jià)結(jié)合，但可以結(jié)合E2和底物，促進(jìn)SUMO由E2向底物轉(zhuǎn)移。SUMO化修飾的生物學(xué)意義SUMO化核內(nèi)底物多數(shù)是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控；參與維持基因組的完整性及

10、調(diào)節(jié)染色體凝集與分離；參與DNA修復(fù)過(guò)程；拮抗泛素的作用，避免蛋白質(zhì)降解。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。六、巴豆?；揎?概念： 是指在巴豆?；D(zhuǎn)移酶催化下，在蛋白質(zhì)賴氨酸添加巴豆?；倪^(guò)程。蛋白質(zhì)巴豆?；揎椀纳飳W(xué)意義 組蛋白賴氨酸巴豆酰化修飾與基因活化密切相關(guān)，機(jī)制目前尚不清楚。七、不同翻譯后修飾的相互協(xié)調(diào)與影響1.在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中存在多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾 脂基化修飾是蛋白質(zhì)磷酸化的開端，磷酸化修飾過(guò)程分別受到特定蛋白激酶調(diào)節(jié)，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的主體。2.一種蛋白質(zhì)可以有一種以上的翻譯后在RNA聚合酶控制的基因表達(dá)過(guò)程中，磷酸化和糖基化對(duì)RNA聚合酶起到了不同的作用。組蛋白乙?；?/p>

11、甲基化共同修飾作用八、蛋白質(zhì)修飾的研究策略 盡管蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)其生物學(xué)功能有著重要的作用，目前對(duì)其規(guī)?；芯渴艿椒治龇椒ǖ南拗?。主要由于翻譯后修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)計(jì)量低，復(fù)雜性造成的。蛋白質(zhì)修飾類型及程度差別大，有的修飾轉(zhuǎn)瞬即逝。 利用電泳、免疫共沉淀、色譜、生物質(zhì)譜、生物信息學(xué)等方法，對(duì)修飾蛋白質(zhì)及修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。第二節(jié) 蛋 白 質(zhì) 的 降 解 蛋白質(zhì)的降解途徑泛素-蛋白酶體通路：需能，高效、特異的蛋白質(zhì)降解過(guò)程，控制著動(dòng)植物體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解。自噬-溶酶體：不需能量。主要降解細(xì)胞外和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)1980年前后Ciechanover A，Hershko A和Rose

12、 發(fā)現(xiàn)了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiqutin-proreasomesystem，UPS）2004年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)UPS參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解UPS組成 有酶促活性的蛋白酶體 20S核心顆粒和蛋白酶體激活因子 選擇性降解短壽命的調(diào)節(jié)蛋白和損傷蛋白。 人體有三種蛋白酶體激活因子 19S（PA100）、11S（PA28或REG）和PA200。ATP和泛素依賴的UPS組成 19S蛋白酶體激活因子結(jié)合20S蛋白酶體， 形成26S蛋白酶體。 細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)泛素化后，都經(jīng)26S蛋 白酶體進(jìn)行降解。26S蛋白酶體的結(jié)構(gòu) 不依賴ATP和泛素的UPS組成11S蛋白酶體激活因子（PA28或REG）因不

13、含ATPase活性，可不依賴ATP和泛素介導(dǎo)蛋白酶體進(jìn)行蛋白質(zhì)降解。PA200是分子量為200kDa單體結(jié)構(gòu)激活因子，可激活蛋白酶體降解肽，而不能降解蛋白質(zhì)。UPS的分類三種激活因子與20S蛋白酶體至少可組成四種蛋白酶體復(fù)合體：19S-20S-19S，11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA200-20S-19S大多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)26S蛋白酶體以ATP和泛素依賴方式降解；11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA200-20S-19S以不依賴ATP和泛素的方式降解一些調(diào)節(jié)蛋白、氧化蛋白及衰老蛋白。泛素的結(jié)構(gòu)與組成 泛素含有76個(gè)氨基酸殘基,廣泛存在于真核生物， 泛素的氨基酸

14、序列極其保守。泛素共價(jià)結(jié)合于底物蛋白的賴氨酸殘基上，將底物蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記而被UPS特異識(shí)別并迅速降解。 泛素激活酶E1：細(xì)胞只表達(dá)一種E1，將泛素轉(zhuǎn) 移到泛素結(jié)合酶E2上； 泛素偶連酶E2：約50種，E2與許多E3作用； 泛素連接酶E3：約1000種，直接或間接與底物 蛋白結(jié)合，促進(jìn)泛素從E2的硫酯鍵轉(zhuǎn)移到底物 蛋白上，作為被UPS識(shí)別和降解的靶向信號(hào)。泛素化過(guò)程的關(guān)鍵酶泛素化反應(yīng)泛素的活化：以ATP為能量，將泛素C-端的羧基連接到泛素活化酶E1的巰基上，形成一個(gè)泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵。泛素活化酶E1將活化后的泛素通過(guò)交酯化反應(yīng)傳遞給泛素結(jié)合酶E2。泛素連接酶E3將E2上的泛素連

15、接到靶蛋白上。 上述過(guò)程循環(huán)往復(fù)，靶蛋白可共價(jià)連接多個(gè)泛素分子，然后被26S蛋白酶體降解。泛素化調(diào)節(jié)和去泛素化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)本身提供特定的UPS識(shí)別信號(hào)。泛素化信號(hào)通常被掩蓋在正常蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下不被降解。蛋白質(zhì)正常結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化或者受損，暴露這些信號(hào)，就會(huì)被UPS發(fā)現(xiàn)。 UPS的生物學(xué)意義 通過(guò)降解錯(cuò)誤的折疊、突變或者損傷的蛋 白質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞的質(zhì)量。 通過(guò)降解關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白來(lái)控制細(xì)胞的基 本生命活動(dòng)。例如生長(zhǎng)、代謝、細(xì)胞凋亡、 細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。泛素-蛋白酶體與疾病 泛素體系酶突變導(dǎo)致功能喪失或目標(biāo)底物 蛋白識(shí)別基序改變，而導(dǎo)致某種蛋白的穩(wěn) 定變化。 目標(biāo)蛋白功能不正?；蚣铀俳到?/p>

16、的結(jié)果。腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用 腫瘤可以起因于癌基因蛋白生長(zhǎng)促進(jìn)因子的穩(wěn) 定或由于腫瘤抑癌基因的不穩(wěn)定。 通過(guò)蛋白酶體降解的癌基因蛋白,如果不能及 時(shí)地從細(xì)胞中清除,就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞惡變。神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用 Parkin是泛素和蛋白的E3連接酶，能與E2共同 作用； Parkin變性，影響某些蛋白降解，引起多巴胺類神經(jīng)元的毒性損傷而引起帕金森病。二、自噬-溶酶體系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)另一個(gè)主要降解途徑是自噬(autophagy)。 自噬是真核生物中高度保守的過(guò)程，可將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常的細(xì)胞器和較為穩(wěn)定的蛋白運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中降解。又稱自噬-溶酶體系統(tǒng)。自噬系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)1962年Ashford

17、TP、Porter KR發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)self-eating現(xiàn)象，提出了自噬(autophagy)。自噬-溶酶體系統(tǒng)1980年Ciechanover A,Hershko A和Rose 發(fā)現(xiàn)了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system,UPS）。獲2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 以色列科學(xué)家 阿龍切哈諾沃 阿夫拉姆赫什科 美國(guó)科學(xué)家 歐文羅斯自噬的概念 概念：是細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過(guò)程。 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬的分類巨自噬（macroautophagy)：細(xì)胞器、蛋白質(zhì)

18、被雙層膜包裹形成自噬體，與溶酶體融合并降解內(nèi)容物。微自噬(microautophagy)：溶酶體通過(guò)膜直接吞噬細(xì)胞質(zhì)長(zhǎng)壽命蛋白，并在溶酶體內(nèi)降解。分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)：只降解特定蛋白質(zhì)，不能降解細(xì)胞器。胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，被溶酶體酶消化。在清除蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性，而前兩者無(wú)明顯的選擇性。蛋白質(zhì)經(jīng)自噬降解的反應(yīng)過(guò)程自噬的誘導(dǎo)激活自噬體的成核和延伸自噬體與溶酶體融合及內(nèi)容物的降解自噬發(fā)生過(guò)程自噬激活成核和延伸自噬體溶酶體自噬溶酶體自噬的誘因細(xì)胞外（缺血、 缺氧、 營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子不足等）；細(xì)胞內(nèi)（代謝壓力、 衰老、 損傷的細(xì)胞器、 蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤等）自噬的生物學(xué)意義 細(xì)胞內(nèi)自噬通常維持在很低的水平，在應(yīng)激條件下被誘導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)性，細(xì)胞通過(guò)自噬維持自身的穩(wěn)定。 自噬體系和蛋白酶體系之間的相互聯(lián)系不同的蛋白質(zhì)降解途徑相互依賴 自噬與UPS之間在功能上有重疊 錯(cuò)誤折疊蛋白可被巨