第五章分子生物學(xué)技術(shù)

1、 第五章 分子生物學(xué)技術(shù)一、名詞解釋1. 分子克隆 2.載體 3. 轉(zhuǎn)化 4. 感染5. 基因工程6. 轉(zhuǎn)導(dǎo) 7. 轉(zhuǎn)染8. DNA 變性9. DNA 復(fù)性 10. 退火12. 原位 PCR13. 定量 PCR15. DNA 芯片17. 核酸探針二、簡答題2、DNA 芯片的原理？3、PCR 的反應(yīng)條件？4、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？7、核酸分子雜交的原理？8、影響雜交的因素？9、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？11、PCR 的基本原理？12、PCR 引物設(shè)計(jì)的基本要求？對天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？答案：一、名稱解釋分子克隆 ： 在體外對 DNA 分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組

2、，將重組分子導(dǎo) 入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該 DNA 分子的大量拷貝。載體： 能在連接酶的作用下和外源 DNA 片段連接并運(yùn)送 DNA 分子進(jìn)入受體細(xì)胞 的DNA分子。轉(zhuǎn)化： 指質(zhì)粒 DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過程?；蚬こ蹋?有目的的通過分子克隆技術(shù)，人為的操作改造基因，改變生物遺傳性狀 的系列過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)： 指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移 DNA 的過程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之 間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞 DNA 的過程。轉(zhuǎn)染： 指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。DNA 變性： 在物理或化學(xué)因素的作用下，導(dǎo)致兩條 DNA 鏈之間的氫

3、鍵斷裂，而核 酸分子中的所有共價(jià)鍵則不受影響。DNA 復(fù)性：當(dāng)促使變性的因素解除后，兩條 DNA 鏈又可以通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合 形成 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)。退火： 指將溫度降至引物的 TM 值左右或以下，引物與 DNA 摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合 形成雜交鏈。13. 定量 PCR ：基因表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研究常需要對 mRNA 進(jìn)行定量測定，對此采用的 PCR 技術(shù)就叫定量 PCR。15. DNA 芯片： DNA 芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量 的 DNA 探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物面， 然后與標(biāo)記的樣品雜交， 通過 對 雜交信號(hào)的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息。

4、由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相 支持物，所以稱為 DNA 芯片。17. 核酸探針： 探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用，并在相互作用之后可以 檢測出來的生物大分子。 核酸探針是指能識(shí)別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段 DNA 或 RNA 分子。二、簡答2. DNA 芯片的原理？答： DNA 芯片技術(shù)就是一種大規(guī)模的集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列 的寡核苷酸片段為探針， 檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)， 然后通過定性定量分析 得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分 子雜交和檢測分子。3. PCR 的反應(yīng)條件？答： A、PCR 反應(yīng)的緩沖液： Tris

5、-HCl 緩沖液 KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì) 抑制 Taq DNA 聚合酶活性。 加入 BSA 或明膠有利于保護(hù) TaqDNA 聚合酶活性。 必 要時(shí)加入適量二甲基亞砜 (DMSO) 或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高 PCR 反應(yīng)特 異性。B、鎂離子濃度一般用量1.5-2.0 mmol/L , Taq DNA聚合酶活性需要 Mg 2+。Mg 2+濃度 過低，會(huì)顯著降低酶活性。 Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg 2+濃度還 會(huì)影響引物的退火、 模板與 PCR 產(chǎn)物的解鏈溫度， 從而影響擴(kuò)增片段的 產(chǎn)率。C、底物濃度工作濃度20-200umol/L , dNTPs濃度

6、過高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的 錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異 性。在 PCR 反應(yīng) 中， 4 種 dNTP 必須以等摩爾濃度配制，以減少 PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配 誤差并提高使用效率。D、Taq DNA聚合酶 75-80 C時(shí)具有最高的聚合酶活性，150個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱 穩(wěn)定性，95C仍有活性，應(yīng)用濃度一般為1-2.5u/100ul反應(yīng)體積。E、引物 0.1-0.5umol/L。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物 二聚體，使 目的 DNA 片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物 Tm 值有關(guān)，引物 Tm 值在 55-80 C范圍較為理想。F、反應(yīng)溫度和

7、循環(huán)次數(shù)分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？答：(1)常用的工具酶：A、限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙 鏈 DNA 分子內(nèi)特定的堿基順 序的核酸水解酶。 B、 DNA 連接酶：將兩段 DNA 分 子拼接起來的酶。C、DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。 D、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA 的 DNA 聚合酶， 這是一種有效的轉(zhuǎn)錄 RNA 成為 DNA 的酶， 產(chǎn)物 DNA 又稱互補(bǔ) DNA。E、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到 DNA的3末端。F、堿 性磷酸酶：催化去除 DNA、RNA等的5磷酸基團(tuán)。G、依賴 DNA的RNA聚合 酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)子， RNA 轉(zhuǎn)錄。（2

8、）良好載體的條件：A、必須有自身的復(fù)制子；B、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi) 切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入；C、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽性重組子 和陰性重組子；D、載體分子必須有足夠的容量；E、可通過特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；F、對于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo) 順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等 DNA 調(diào)控元件。7、核酸分子雜交的原理？ 答：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿 基互補(bǔ)配對結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化， 以及在復(fù)性過程中個(gè)分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測核酸和已知

9、序列。8、影響雜交的因素？答：（ 1）核酸分子的濃度和長度：核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長度應(yīng)控制在50-300 個(gè)堿基對為好。（ 2）溫度：溫度過高不利于復(fù)性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離， 適宜的溫度是較 TM 值低 25 度。（ 3）離子強(qiáng)度：在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。（ 4）雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的 TM 值。它有以下優(yōu)點(diǎn)：在低溫下探 針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價(jià)結(jié) 合的核酸。 （5）

10、核酸分子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。兩 個(gè)不同基因組 DNA 變性后的相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時(shí)的相對復(fù)雜性（即 DNA 中的堿基 數(shù)）。（6）非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前應(yīng)對非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對探 針的非特異性吸附作用。9、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？答：（ 1） cDNA 探針：通過逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過 擴(kuò) 增重組質(zhì)粒而使 cDNA 得到大量的擴(kuò)增。 提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用。 它是 目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。（2）基因組探針：從基因組文庫里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后， 大量擴(kuò) 增、純化，切

11、取插入片段， 分離純化為探針。 （3） 寡核苷酸探針： 根據(jù)已知的核酸順序， 采用 DNA 合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段 作為探針。 （ 4） RNA 探針：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到 RNA 或反義RNA 作為探針。11、 PCR 的基本原理？答： PCR 是在試管中進(jìn)行的 DNA 復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi) DNA 半保留復(fù) 制的機(jī)理， 以及體外 DNA 分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)， 人為地 控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈 DNA 變成單鏈，單鏈 DNA 與人工合成的引 物退火，然后耐熱 DNA 聚合酶以 dNTP 為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈

12、 DNA。PCR 全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行 DNA 模板 解鏈、引物與模板 DNA 結(jié)合、 DNA 聚合酶催化新生 DNA 的合成，即高溫變性、低 溫退火、中溫延伸 3 個(gè)步驟構(gòu) 成 PCR 反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使 目的 DNA 得以迅速擴(kuò)增。DNA 模板 變性：模板雙鏈 DNA?單鏈DNA , 94 C。退火：引物+單鏈 DNA?雜 交鏈，引物的 Tm值。引物的延伸：溫度至 70 C左右， Taq DNA聚合酶以4種 dNTP 為原料，以目的 DNA 為模板，催化以引物 3末端為起點(diǎn)的 53DNA 鏈延伸反 應(yīng)，形成新生 DNA 鏈。新合成

13、的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的 模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。PCR 引物設(shè)計(jì)的基本要求？答：（1）引物長度一般為 1530個(gè)核苷酸。過短影響 PCR的特異性，過長會(huì)提高 相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度 74C，影響產(chǎn)物的生成。（ 2 ）引物的堿基盡可能隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3端不應(yīng)有連續(xù) 3個(gè)G和C。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對。G+C含量一般占45%-55%。3端和5端引物具有相似的 Tm值,Tm 值計(jì)算公式：Tm = 4（G+C）+ 2（A+T）。（3）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般 不超過 3bp。（4） 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70%，引物 3末端連續(xù) 8 個(gè)堿基在 待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。（6） 引物 3端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA 配對。引物 3端最佳 堿基選擇是G和C,形成的堿基配對比較穩(wěn)定。（7） 引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響 PCR 反應(yīng)的 進(jìn)行。（8）引物的 5端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物