真核細(xì)胞DNA提取和酶切鑒定

1、真核細(xì)胞DNA提取和酶切鑒定生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安排實(shí)驗(yàn)室實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容一實(shí)驗(yàn)16：DEAE纖維素離子交換層析二實(shí)驗(yàn)17：血清-球蛋白的提純實(shí)驗(yàn)8 ：醋酸纖維素薄膜電泳三實(shí)驗(yàn)9 ：聚丙烯酰胺凝膠電泳四實(shí)驗(yàn)3 ：測(cè)定蛋白質(zhì)的比色分析法實(shí)驗(yàn)12：血清脂蛋白的瓊脂糖凝膠電泳五實(shí)驗(yàn)18：真核基因組DNA的分離提取六實(shí)驗(yàn)7 ：酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)第一輪第二輪：考試（6個(gè)實(shí)驗(yàn)室）實(shí)驗(yàn)本身:實(shí)驗(yàn)室規(guī)則:時(shí)間、穿著、儀器不能亂動(dòng)、賠償制度、整潔、衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)報(bào)告（如實(shí)記錄）規(guī)范操作（辨認(rèn)標(biāo)簽）、污染物、毒物、廢棄物（酸堿燒傷大量自來水沖洗）規(guī)則實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：題目，組號(hào)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)操作：如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果

2、分析：實(shí)事求是討論或小結(jié)：認(rèn)真分析，仔細(xì)思考真核細(xì)胞基因組DNA的分離提取及酶切電泳7/23/20225 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握人外周血基因組DNA的提取原理、原 則、提取方法和注意事項(xiàng)，熟悉外源基因 的基本制備方法。2. 學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理 和技術(shù)。基因組DNA提取的操作流程 實(shí)驗(yàn)步驟、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml Eppendorf 離心管中。 抗凝劑 EDTA-Na2或枸櫞酸鈉作為抗凝劑 不宜使用肝素 、加入1ml STMT，充分混勻 使其溶血。STMT （破壞細(xì)胞膜)葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機(jī)械作 用而降解。TrisHCl:不含金屬離子,與

3、EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。Triton X-100:非離子去污劑（表面活性劑），直接破裂 血中紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜，釋出血紅蛋白及 細(xì)胞核。MgCl2: 提供Mg2+，穩(wěn)定DNA。 、10000g離心2min，棄上清。注意離心機(jī)的使用 配平 上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。4、用0.4ml生理鹽水洗沉淀，10000g 離心2min，棄上清。注意離心機(jī)的使用 配平 上清丟棄到廢液缸，盡量空凈。、加450lNE溶液將沉淀重新懸浮。NENaCL: 50mmol/L EDTA: 1.二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、加50l 10%SDS，迅速混勻;再加50l蛋 白酶K，輕輕搖勻后置5

4、0水浴1h。SDS 1. 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細(xì)胞膜破裂2. 溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來3. 對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用4. 與蛋白質(zhì)形成R-O-SO3 .R蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K(或鏈霉蛋白酶) 廣譜蛋白酶，水解蛋白質(zhì)。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。、加入TE飽合酚500l，輕搖2min，10000g離心 1min，將上層水相移至另一新Eppendorf管內(nèi)。酚能有效地使蛋白質(zhì)變性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10一15的水分。、加入酚氯仿異戊醇混合液500l，輕搖 1min，10000g離心1min，將上層水相移至另 一Eppen

5、dorf管內(nèi)。氯仿也是一種蛋白變性劑，但氯仿的變性作用不如酚。氯仿有助于加速有機(jī)相和水相的分離；使用兩種不同的有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一一種有機(jī)溶劑效果好。酚和氯仿兩者交替反復(fù)抽提，還可克服酚的缺點(diǎn)。、加入氯仿異戊醇混合液500l，輕搖 1min，10000g離心1min，將上層水相移至另 一新Eppendorf管內(nèi)。（定體積）移上清時(shí)要定量，寧少勿多氯仿： 將殘留在水相中的酚帶走 也可以再次使蛋白變性異戊醇： 降低分子表面張力，減少氣泡產(chǎn)生 有助于分層 上層為水相 中間為變性的蛋白 下層為有機(jī)相10、向上清中加入1/10體積的NaAc ，并混勻。 再加入2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻， 于

6、80放置10min。核酸是多聚陰離子的水溶性化合物，能與鈉、鉀、鎂等很多1價(jià)、2價(jià)陽離子形成鹽類而沉淀，在許多種有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)被變性。最常用的沉淀劑為1價(jià)鈉、鉀、銨和鋰等離子鹽類，如醋酸鈉、氯化鈉等。常用有機(jī)沉淀劑有：乙醇、異丙醇、聚乙二醇等。11、10,000g離心5min，棄上清, 將小 管倒置于濾紙上。室溫干燥5min。12、加入20l雙蒸水溶解基因組DNA ?；蚪MDNA 8l10 X 緩沖液 1l EcoR 1l 離心甩一下，37溫浴1h。另外剩余的10l留做電泳分析用。酶切體系 酶切注意事項(xiàng)按順序加樣，每加一個(gè)樣品更換一次tip頭一定要將酶加進(jìn)去加酶的時(shí)候一定保證低溫，在

7、冰上操作加完后要充分混勻，用離心機(jī)“甩”一下再水浴（配平后，隨意調(diào)時(shí)間，將轉(zhuǎn)速調(diào)到接近最大值，即刻再調(diào)回零）13、1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)10L 酶切后基因組DNA 2L 10Loading buffer12L基因組DNA 2L 10Loading buffer1TBE 恒壓100V 電泳 0.5-1h 實(shí)驗(yàn)原理核酸：包括DNA、RNA兩種分子。 DNA RNA多呈單鏈線性分子雙鏈線性分子雙鏈環(huán)狀分子 真核生物DNA95%存在于細(xì)胞核5%存在于細(xì)胞器真核生物RNA10%存在于細(xì)胞核15%存在于細(xì)胞器75%存在于細(xì)胞質(zhì) 分離純化核酸總的原則應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染 完整性的保證盡

8、量簡化操作步驟，縮短提取過程減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解減少物理因素對(duì)核酸的降解 如機(jī)械剪切力、高溫防止核酸的生物降解 DNA酶、RNA酶 純度的保證核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度排除其它核酸分子的污染 從全血中制備基因組DNA首先用去污劑TritonX-100直接破裂紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜，使之釋放出血紅蛋白及細(xì)胞核，通過離心分離即可獲得白細(xì)胞核；用SDS破壞核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，從而使DNA釋放入水相中。用酚氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，再用氯仿除去DNA溶液中殘存的

9、蛋白質(zhì)及酚；用無水乙醇沉淀水相中的DNA，即可獲得基因組DNA。Concise process：破裂細(xì)胞消化蛋白質(zhì)有機(jī)抽提除去蛋白質(zhì)沉淀水相中的DNA。DNA抽提示意圖 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是識(shí)別DNA的特異序列, 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HMolecular scissor 均來自微生物，并據(jù)此而進(jìn)行命名； 識(shí)別序列長度常為4 8 核苷酸序列 ; 大部分酶識(shí)別序列呈二元旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu) 即回文結(jié)構(gòu) ; 其切割后的DNA可產(chǎn)生不同的末端。限制酶的特點(diǎn)（類酶） DNA的瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是從海洋植物瓊

10、脂中提取來的，為一種聚合鏈線性分子。 線性DNA分子在電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)成反比 DNA的空間構(gòu)型不同，即使分子量相同其遷移率也不相同 Making an Agarose GelCasting trayGel combsPower supplyGel tankCoverElectrical leads Electrophoresis EquipmentGel casting tray & combsThe tray is the actual mold which provides a shape for the gel as it polymerizes. The comb can

11、 make some “wells” in the gel.Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.Preparing the Casting TrayAgaroseAgarose is a linear polymer extracted from seaweed.D-galactose3,

12、6-anhydroL-galactoseAgaroseBuffer SolutionCombine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.Agarose is insoluble at room temperature (left).The agarose solution is boiled until clear (right). Microwave for about 1 minute to dissolve th

13、e agarose.Melting the AgaroseAllow the agarose solution to cool slightly (60C) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Push any bubbles away to the side using a disposable tip.Pouring the gelEach of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

14、When cooled, the agarose polymerizes, forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape. Place the gel in the electrophoresis chamber.buffer Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1

15、 mm. Make sure each well is filled with buffer.Cathode(negative)Anode(positive)wellsDNA Loading Buffer: Bromophenol Blue (for color) Glycerol (for weight)Sle PreparationMix the sles of DNA with the loading buffer (w/ tracking dye). This allows the sles to be seen when loading onto the gel, and incre

16、ases the density of the sles, causing them to sink into the gel wells.Loading the GelCarefully place the pipette tip over a well and gently expel the sle. The sle should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.Place the cover on the electrophoresis chamber, connec

17、ting the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). Running the Gel wells Bromophenol BlueCathode(-)Anode(+)GelAfter the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run in

18、the same direction as the DNA.DNA(-)Staining the Gel*CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times. Ethidium bromide(EB) is the special dye of DNA molecules. It binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel. Ethidium bromide c