農(nóng)藥的代謝學(xué)習(xí)

1、農(nóng)藥的代謝學(xué)習(xí)代謝研究方法活體研究in vivo in vitro組織勻漿沉淀（細胞核、組織碎片） 濾液 上清液 沉淀（葉綠體） 上清液 沉淀（線粒體） 上清液（胞液、核糖體 ） 沉淀（微粒體）100,000105,000g, 1hr9,00011,000g, 30min1,0003,000g, 10min過濾代謝酶 初級代謝酶水解酶、多功能氧化酶（MFO）次級代謝酶谷光甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（ GST ）、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（glucuronyl transferase）、硫酸轉(zhuǎn)移酶（sulphate esterase）、甘氨酸轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 多功能氧化酶（MFO） RH O2 2H ROH

2、H2OMFO是膜結(jié)合酶。主要由P450、NADPH-細胞色素還原酶、NADH-細胞色素b5還原酶、磷脂等成份構(gòu)成。其中細胞色素P450的還原形式與CO結(jié)合后在450 nm附近產(chǎn)生特征吸收峰，故命名為P450。細胞色素P450幾乎在所有的生物中都存在，包括動物、植物、昆蟲、細菌等。反應(yīng)機理P450本質(zhì)上屬于血紅素硫鐵蛋白（heme-thiolate protein），上面有底物和氧的結(jié)合位點。NADPH-細胞色素還原酶和NADH-細胞色素b5還原酶在酶系中起電子傳遞作用。 This entire reaction cycle usually takes between 1 and 10 seco

3、nds P450的多樣性 根據(jù)分類命名系統(tǒng), P450蛋白或基因全序列同源部分40%為同一家族（family）, 用一阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性40%65%為同一亞族（subfamily）界限，在家族表達式后加一大寫英文字母；每一亞族內(nèi)的單個酶則在表達式后再加一阿拉伯?dāng)?shù)字 哺乳動物目前已知哺乳動物體內(nèi)有14 個CYP450 家族, 即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51 （夏偉 ，2000）。其中CYP1 CYP4 家族是代謝外來化合物的主要酶系, 并且各同工酶有其較固定的代謝底物、反應(yīng)類型。CYP1A 的底物以環(huán)境致癌物為主, 如多環(huán)芳烴、黃曲霉毒素。CYP2E1

4、 則主要參與乙醇等小分子化合物的代謝, 特別是亞硝胺在體內(nèi)產(chǎn)生致癌、誘變產(chǎn)物必須經(jīng)CYP2E1 的A2羥化作用。 大多數(shù)臨床口服藥物在體內(nèi)的代謝酶是CYP3A。 植物植物的第一個P450cDNA 是CYP71A1 ,它是由Bozak等（1990 ）由鱷梨中分離出的與成熟有關(guān)的P450基因。至今已鑒定了90多個植物P450 基因。它們分屬于27 個家族（CYP51, CYP71, CYP72 CYP96)（劉宛等，2001） 昆蟲昆蟲的第一個P450cDNA是Snyder和Davidson （1983）從果蠅Drosophila mdanogaster中分離的，但當(dāng)時并不知道它是細胞色素P450

5、基因，后來被重新發(fā)現(xiàn)而被定名為CYP4E1。昆蟲的P450基因總數(shù)尚不清楚，至今已鑒定的昆蟲P450基因已超過50個，分屬6個基因家族(CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP28，CYP18)。其中CYP4，CYP6，CYP9，CYPI2，CYP28等5個基因家族為昆蟲所特有（潘貽武等，2007） 。P450的可誘導(dǎo)性P450可以代謝許多親脂化合物，包括膽固醇、類固醇、激素、維生素D等內(nèi)源化合物和外源非極性化合物。天然化合物 除蟲菊素pyrethrins、單萜類monoterpene、黃酮類flavonoid、香豆素coumarins、甾醇、異黃腦素、2十三烷酮、2十三烷酮、吲哚3甲

6、醇、尼古丁、胡蘿卜素、己醇、保幼激素、蛻皮酮、等等。人工化合物苯巴比妥phenobarbital(BP)、3甲基膽蒽（3MC）、DDT、環(huán)戊二烯類殺蟲劑、萘napthaiene、西維因、有機磷化合物（TOCP、TPP、DEF）、丁羥基丁氧化物butylhydroxy butoxide、丁羥基甲苯butylhydroxy toluene、烷基苯alkylbenzenes、polychlorinated bephenyls（PCBs）、增效醚piperonyl butoxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenylureas、保幼激素類似物、等等（邱星輝、冷欣夫，1997） 根據(jù)現(xiàn)有資料，

7、細胞色素P450能夠被大約200種化合物誘導(dǎo)，能夠催化約40種類型的化學(xué)反應(yīng)，現(xiàn)有底物約1,000種（邱星輝、冷欣夫，1997）。MFO參與的代謝反應(yīng) 烷基羥化芳基羥化O烷基羥基化N烷基羥基化環(huán)氧化脫S（活化）S加氧（活化）MFO與抗藥性的關(guān)系 家蠅CYP6A1能夠?qū)蟿┖吐鹊し謩e氧化為狄氏劑和環(huán)氧化氯丹 。重組桿狀病毒感染的鱗翅目細胞系統(tǒng)中表達的CYP6A2除了能夠?qū)蟿┖吐鹊ぱ趸鄳?yīng)的環(huán)氧化物，還能通過脫硫作用和氧化酯解作用分別將有機磷殺蟲劑二嗪磷diazinon代謝為diazoxon和2異丙基4甲基6羥基嘧啶。果蠅CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表達 CYP6D1mRNA的高效

8、表達與家蠅對二氯苯醚菊酯的抗性有關(guān) （朱禮華等，2000） CYP4mRNA的高效表達與淡色庫蚊對溴氰菊酯的抗性有關(guān) （朱昌亮等，2001） MFO的檢測 P450含量測定 底物氧化法mRNA含量測定 P450含量測定特征光譜：還原性P450與CO結(jié)合后在450nm處有最大吸收峰在加有適量連二亞硫酸鈉的試管里，加入微粒體懸液，混勻，通CO氣體1min，在分光光度計上400500 nm 范圍進行掃描。計算公式為P450=(A450一A490)(91Pr)1 000(nmolmg蛋白)，其中91為吸光系數(shù)，Pr為蛋白質(zhì)濃度(mgmL) （嚴敏芬等，2006）底物氧化法7-乙氧基異吩惡唑 7-乙氧基

9、異吩惡唑0-脫乙基酶（EROD）7-乙氧基豆香素 7-乙氧基豆香素0-脫乙基酶（ECOD）苯并芘BaP 芳基羥化酶(AHH) 艾氏劑 環(huán)氧化酶 芳香基羥基化酶（aryl hydroxylase，AHH）劉永杰 等 （ 2005）以苯并芘為底物得抗氯氟氰菊酯的甜菜夜蛾品系中腸微粒體AHH比敏感品系高1.51倍O-烷基羥基化酶用對硝基苯甲醚，又稱對硝基茴香醚（p-nitroanisole, PNA）為底物。反應(yīng)生成的對硝基酚在堿性條件下呈黃色，在400nm波長下比色： N-烷基羥基化酶以對氯-N-甲基苯胺為底物，每5毫升的反應(yīng)體系中加入3mol。用含6%對二甲基氨基苯甲醛的3mol/L硫酸溶液中止

10、反應(yīng)，在387納米波長下比色： 環(huán)氧化酶 用艾氏劑作底物，由氣相色譜法檢測（劉永杰 等，2005）。 測定MFO較為靈敏的方法，是以7-乙氧基異吩惡唑或7-乙氧基豆香素作底物，以熒光法測定酶的脫O-烷基（EROD，ECOD）活性。測定EROD活性的反應(yīng)體系中，7-乙氧基異吩惡唑的添加量只需要1mol/L,用對硝基苯甲醚和對氯-N-甲基苯胺作底物時，底物添加量分別需達到800mol/L和600mol/L。以熒光法測定EROD活性時，取激發(fā)波長537納米，發(fā)射波長為583納米。EROD酶源和輔基MFO的催化反應(yīng)需要還原型輔酶II（NADPH）的參與可直接使用NADPH，也可以用NADP、葡萄糖-6

11、-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成的NADPH生成系統(tǒng)作輔酶。 檢測MFO的催化反應(yīng)多以微粒體作為酶源ERODCYP1A1MRODCYP1A2PRODCYP2B1/2B2ethoxyresorufinmethoxyresorufinpentoxyresorufin 酯酶 羧酸酯酶（B-酯酶 ，EC 3.1.1.1 ）馬拉硫磷芳基二烷基磷酸酯酶（A-酯酶 ，EC 3.1.8.1 ，對氧磷酶 ）酯酶在害蟲有機磷的抗性中起著極為重要的作用，在對氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯的抗性中也起一定作用。酯酶在抗性機制中具有兩個作用通過水解作用產(chǎn)生無毒代謝產(chǎn)物結(jié)合作用殺蟲劑，形成磷?；富虬被柞；?，使殺蟲劑不能到

12、達靶標(biāo)。兩者均能起到保護體內(nèi)靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶免受抑制。酯酶與抗藥性酯酶參與的代謝反應(yīng)酰胺（水解）酶樂果芳基酰胺（水解）酶敵稗環(huán)楊化物水解酶西維因酯酶的檢測酯酶可水解-醋酸萘酯為醋酸和-萘酚。后者與固藍B鹽反應(yīng)生成一個藍紫色物質(zhì)（=550600納米nm）。酯酶的檢測也可以用-醋酸萘酯作底物，產(chǎn)物呈紫紅色。pH對顯色反應(yīng)有很大影響。染液中可加入45%的SDS，一來增色，二來終止反應(yīng)。-和-醋酸萘酯為非特異性底物，檢測昆蟲酯酶時，可在反應(yīng)體系中加入10-7 mol/L左右的毒扁豆堿，以消除膽堿酯酶的活性 。毒扁豆堿不能排除其它酯酶，如A-酯酶的活性。所幸A-酯酶一般只存在于哺乳動物體內(nèi)。谷光甘肽-s

13、-轉(zhuǎn)移酶（ GST ） 根據(jù)底物的不同， GST （EC 2.5.1.18 ）又可以分為谷胱甘肽-S-烷基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-芳基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽-S-環(huán)氧化物基轉(zhuǎn)移酶。以還原型glutathione（甘氨酸胱氨酸谷氨酸）作為輔酶無論哺乳動物動物，還是昆蟲體內(nèi)的GST，多以二聚體形式存在。根據(jù)等電點的不同，可以分為堿性（）、中性（）、酸性（）三種類型 GST參與的代謝反應(yīng)西維因carbaryl阿特拉津atrazine GST參與的代謝反應(yīng)二嗪農(nóng)diazinon 對氧磷paraoxon GST的檢測谷胱甘肽-S-烷基轉(zhuǎn)移酶以14C標(biāo)記的碘甲烷為底物，在酶的催化下，碘甲烷與谷胱甘肽生成不揮發(fā)的衍

14、生物，未反應(yīng)的碘甲烷以溴甲醇除去，通過對標(biāo)記物的測定求出酶活性：GST的檢測谷胱甘肽-S-芳基轉(zhuǎn)移酶 以1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）或1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）為底物DCNB或CDNB與還原型谷胱甘肽產(chǎn)生軛合物，在360納米波長下有最大吸收峰 據(jù)Fournier（1995）等的報道，家蠅體內(nèi)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可分為兩種：酶活性的最適pH為酸性（6.5）的種類對1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）活性高，最適pH為堿性（8.0）的種類對1，2-氯-4-硝基苯有較高活性(DCNB)。 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（glucuronyl transferase） 主要存在于哺乳動物體內(nèi)。 輔酶：尿嘧啶核糖焦磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA） 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶參與的代謝反應(yīng)1西維因carbaryl 葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶參與的代謝反應(yīng)2福美鐵ferbm 硫酸轉(zhuǎn)移酶（sulphate transferase, sulfotransferase ） 存在于哺乳