[農(nóng)業(yè)]高效液相色譜課件

1、高效液相色譜技術與應用 （十二）HPLC方法論證與移植方法誰研究的組成部分準確度精密度線性范圍檢測限定量限專屬性普適性強健性樣品、試劑、儀器的穩(wěn)定性與系統(tǒng)的適用性標準準確度 (Accuracy)準確度確定的三種方法：與參比標準品比較回收測定摻入空白基質(zhì)中的被測物被測物的標準品加入法精密度(Precision)國際協(xié)調(diào)會(ICH)提出的精密度分三種類型： 重復性重復性為一種方法在相同的操作條件下短時間內(nèi)的精密度。其中一個方面為儀器精密度，通過依次重復進樣分析同一均勻樣品10以上，并平均面積或峰高值，以確定全部進樣的相對標準(RSD)，可測該精密度。另一方面為分析內(nèi)精密度，包括同一分析人員在同一條

2、件下，對同一樣品的多次測定中間精密度指在同一實驗室內(nèi)多次使用同一方法時，全部測定結(jié)果的一致性。包括不同日期、儀器或被測物的全分析，也包括多次配制的樣品和標準品。重現(xiàn)性檢驗實驗室間的精密度，往往在協(xié)作研究或方法移植實驗中進行測定。線性(Linearity)方法的線性是衡量響應值與濃度的校正曲線近似為一條直線的程度。大多數(shù)方法，尤其是定量分析主成分時，其線性相關系數(shù)大于0.999既可。范圍 (Range)方法的范圍可定義為分析方法有足夠的準確度、精密度和線性的最高和最低濃度。濃度的范圍應包括所測樣品的期望值。在目標的50、75、100、125與150%進行研究是好策略。檢測限和定量限(Limit

3、of Detection & Limit of Quantitation)一個方法有兩個重要特性：檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。在方法論證期間測得的LOD和LOQ值受分離條件的影響：色譜柱、試劑，尤其是儀器設備與數(shù)據(jù)系統(tǒng)。專屬性(Specificity)專屬性為大多數(shù)分析方法中最重要指示，可定義為在其它樣品物質(zhì)存在的條件下可準確測定被測物濃度的能力。測定方法專屬性能用兩種方法：測試所有可能的干擾化合物以證明它們都能與檢測物峰分離，并達到規(guī)定的分離度。使用選擇性檢測器，特別是對共流出的化合物。普適性(ruggedness)方法的普適性被定義為方法在實際應用條件下運行時，其結(jié)果的重現(xiàn)性。包括

4、不同的分析人員、實驗室、色譜柱、儀器、化學試劑與溶劑的來源等等。強健性(Robustness)強健性定義為方法被微小的、但有意的參數(shù)改變對結(jié)果影響的承受能力。強健性最重要的方面是建立能預測分離參數(shù)變化對結(jié)果影響的方法考察方法強健性的有效方法是用統(tǒng)計學實驗設計，同時評估多個參數(shù)。穩(wěn)定性(Stability)為了得到重現(xiàn)性好和可靠的結(jié)果，HPLC方法中使用的樣品、標準品和試劑在適宜的時間內(nèi)必須穩(wěn)定。即使是單一樣品的分析，測定系統(tǒng)的適用性也需10次以上的色譜操作，包括制作工作曲線的標準濃度，二次或三次地重復測定被測樣品。時間與溫度對試劑與溶液的穩(wěn)定性都很重要選擇流動相時應注意穩(wěn)定性問題，特別是使用胺

5、添加劑或特殊溶劑時色譜柱的長期穩(wěn)定對方法的普適性十分關鍵。系統(tǒng)適用性(System Suitability)每天在樣品分析之前，操作人員必須確定HPLC系統(tǒng)和操作步驟捅提供質(zhì)量可靠的數(shù)據(jù)。系統(tǒng)適用性試驗可定義為：為確保方法產(chǎn)生的結(jié)果具有可接受的準確性和精密度的實驗測試一般將同一種標準溶液五次重復進樣分析的峰高或峰面積的RSD作為標準之一一主成分的定量分析，其RSD值一般應小于1%。痕量分析時較高的RSD (515%)也可接受。論證結(jié)果和最終方法的文件形成任何方法論證的一個重要內(nèi)容是將論證實驗以有適當?shù)慕Y(jié)論編制成文件?？刹扇渫?、簡報或更正式的書面記錄形式。實驗室間的交叉研究(可移植性)測定等同性，一般利用統(tǒng)計學進行檢驗：t-檢驗：比較兩次實驗的平均結(jié)果或確定一樣本均值是否存在差異F-檢驗：比較兩次研究的差異方差分析(ANOVA)：比較兩組以上的數(shù)據(jù)，如進行同一測試的多個實驗室間的比較Q-檢驗：評估統(tǒng)計學等同性通常通過比較置信度水平為95%的數(shù)據(jù)。在進行這類分析和比較時，數(shù)據(jù)偶爾會超出可接受的數(shù)值范圍。這時可適宜地利用Q-檢驗。方法論證方案方法論證方案b. 任何一組的6次測