生物傳感器發(fā)展歷史和、分類(lèi)和趨勢(shì)展望

1、生物傳感器發(fā)展歷史和、分類(lèi)和趨勢(shì)展望目錄七.生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)和展望第一階段：20世紀(jì)60一70年代，為起步階段，以Clark傳統(tǒng)酶電極為代表。第二階段：20世紀(jì)70年代末期到80年代，大量的學(xué)科交叉出現(xiàn)各種不同原理和技術(shù)的生物傳感器，尤其80年代中期是生物傳感器發(fā)展的第一個(gè)高潮時(shí)期，其代表之一是介體酶電極，它不僅開(kāi)辟了酶電子學(xué)的新研究方向，還為酶?jìng)鞲衅鞯纳唐坊於酥匾A(chǔ)。第三階段：20世紀(jì)90年代以后，有兩個(gè)象征：一是生物傳感器的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)獲得顯著成績(jī)；二是生物親和傳感器的技術(shù)突破，以表面等離子體和生物芯片為代表，成為生物傳感器發(fā)展的第二個(gè)高潮。1962年，Clark教授酶電極1967年

2、，Updike,Hicks酶?jìng)鞲衅?0世紀(jì)80年代，牛津出版社生物傳感器：基礎(chǔ)與應(yīng)用1990年，在新加坡召開(kāi)了“首屆世界生物傳感器學(xué)術(shù)大會(huì)”生物傳感器是一個(gè)非?；钴S的研究和工程技術(shù)領(lǐng)域，它與生物信息學(xué)、生物芯片、生物控制論、仿生學(xué)、生物計(jì)算機(jī)等學(xué)科一起，處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域。它們的共同特征是：探索和揭示出生命系統(tǒng)中信息的產(chǎn)生、存儲(chǔ)、傳輸、加工、轉(zhuǎn)換和控制等基本規(guī)律，探討應(yīng)用于人類(lèi)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)等的基本方法。生物傳感器技術(shù)的研究重點(diǎn)是：廣泛地應(yīng)用各種生物活性材料與傳感器的結(jié)合，研究和開(kāi)發(fā)具有識(shí)別功能的換能器，并成為制造新型的分析儀器和分析方法的原創(chuàng)技術(shù)，研究和開(kāi)發(fā)它們的應(yīng)用。生物傳感器中應(yīng)

3、用的生物活性材料對(duì)象范圍包括：生物大分子、細(xì)胞、細(xì)胞器、組織、器官等，以及人工合成的分子印跡聚合物。目前，研究DNA分子或蛋白質(zhì)分子的識(shí)別技術(shù)已形成生物芯片獨(dú)立學(xué)科領(lǐng)域。(biosensor)：是指對(duì)生物物質(zhì)敏感,并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。生物傳感器的組成主要分為兩個(gè)部分：分子識(shí)別元件（生物敏感膜）和換能器（一次儀表）。是指固定化的生物敏感材料，是生物傳感器的關(guān)鍵元件，直接決定傳感器的功能與質(zhì)量。依生物敏感膜所選材料不同，其組成可以是酶、核酸、免疫物質(zhì)、全細(xì)胞、組織、細(xì)胞器或它們的不同組合。換能器的作用是將各種生物的、化學(xué)的和物理的信息轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的信息是多元化

4、的，微電子學(xué)和傳感技術(shù)的現(xiàn)代成果為檢測(cè)這些信息提供了豐富的手段，使得研究者在設(shè)計(jì)生物傳感器時(shí)對(duì)換能器的選擇有足夠的回旋余地。主要的換能器包括氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等。概念：將具有分子識(shí)別能力的生物功能物質(zhì)，包藏或吸附于某些高分子材料，生物高分子或無(wú)機(jī)材料，如分子篩內(nèi)制備成感應(yīng)器，稱(chēng)為生物功能物質(zhì)的固定化。常用固定化方法：夾心法（隔離法）、包埋法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、微膠囊法。是將生物活性材料封閉在雙層濾膜之間。依生物材料的不同而選擇各種孔徑的濾膜。尤其適用于微生物和組織膜的制作。商品BOD傳感器的膜就是用這種方法制作的。用于酶膜制作時(shí)穩(wěn)定性較差。 濾膜的選擇生物組分膜孔徑膜

5、類(lèi)型酶10300A超濾膜、透析膜組織0.510m微濾膜微生物0.0510m微濾膜是用非水溶性載體物理吸附或離子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子固定化的方法。載體種類(lèi)繁多，如活性炭、高嶺土、羥基石灰石、鋁粉、硅膠、玻璃、膠原、磷酸鈣凝膠、纖維素和離子交換器等。吸附法主要用于制備酶和免疫膜，吸附過(guò)程一般不需要化學(xué)試劑，對(duì)蛋白質(zhì)分子活性影響較小，使蛋白質(zhì)分子容易脫落，特別在環(huán)境條件改變時(shí)。故常常與其它固定化方法結(jié)合使用，如吸附交聯(lián)法。將酶分子或細(xì)胞包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中。包埋法的特點(diǎn)是一般不產(chǎn)生化學(xué)修飾，對(duì)生物分子活性影響較小，膜的孔徑和幾何形狀可任意控制，被包埋物質(zhì)不易滲漏，底物分子可以

6、在膜中任意擴(kuò)散，缺點(diǎn)是分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴(kuò)散較困難，因此，不適合大分子底物的測(cè)定。是生物活性分子通過(guò)共價(jià)鍵與不溶性載體結(jié)合而固定的方法。蛋白質(zhì)分子中能與載體形成共價(jià)鍵的基團(tuán)有游離氨基、羧基、巰基、酚基和羥基等。有機(jī)載體如纖維素及其衍生物、葡聚糖、瓊脂粉、骨膠原等，無(wú)機(jī)載體使用較少，主要有多孔玻璃、石墨等。根據(jù)酶與載體之間的結(jié)合形式可以有重氮法、肽鍵法、烷化法等，以重氮法較為多用。共價(jià)結(jié)合法多用于酶膜和免疫分子膜的制作。此法借助雙功能試劑使蛋白質(zhì)結(jié)合到惰性載體或蛋白質(zhì)分子彼此交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。交聯(lián)法廣泛用于酶膜和免疫分子膜制備，操作簡(jiǎn)單，結(jié)合牢固，在酶源困難時(shí)常常需要加入數(shù)倍酶的惰性蛋白質(zhì)

7、作為基質(zhì)。本法存在的問(wèn)題是在進(jìn)行固定化時(shí)需要嚴(yán)格控制pH，一般在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近操作。在交聯(lián)反應(yīng)中，酶分子不可避免地會(huì)部分失活。被分析物擴(kuò)散進(jìn)入固定化生物敏感膜層，經(jīng)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的化學(xué)換能器或物理?yè)Q能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號(hào)，再經(jīng)二次儀表(檢測(cè)放大器)放大并輸出，便可知道待測(cè)物濃度。與傳統(tǒng)的分析方法相比，生物傳感器這種新的檢測(cè)手段具有如下的優(yōu)點(diǎn)：生物傳感器是由選擇性好的生物材料構(gòu)成的分子識(shí)別元件，因此一般不需要樣品的預(yù)處理，樣品中的被測(cè)組分的分離和檢測(cè)同時(shí)完成，且測(cè)定時(shí)一般不需加入其他試劑；由于它的體積小，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測(cè)；響應(yīng)快，樣品用量少，且由

8、于敏感材料是固定化的，可以反復(fù)多次使用；傳感器連同測(cè)定儀的成本遠(yuǎn)低于大型的分析儀器，便于推廣普及。 生物傳感 器的優(yōu)點(diǎn) 可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)靈敏度高快捷可微型化可操作性強(qiáng)測(cè)定簡(jiǎn)便選擇性好便于攜帶31、根據(jù)生物傳感器中生物分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)分：核酸傳感器分子印跡生物傳感器通過(guò)對(duì)抗原抗體、 酶和底物反應(yīng)原理的研究和理解 ,科學(xué)家大膽提出了通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成模擬抗體的設(shè)想 ,開(kāi)創(chuàng)了一項(xiàng)嶄新的技術(shù) 分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique , MIT)。通過(guò)MIT合成的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers , MIPs)被稱(chēng)為 “塑料

9、抗體”,科學(xué)家因此實(shí)現(xiàn)了不依賴(lài)生物活體獲得 “抗體” 的宿愿 ,以此 “塑料抗體” 取代生物分子作為識(shí)別元件研制分子印跡仿生傳感器(MIPs仿生傳感器)的工作 ,在20 世紀(jì)90 年代后逐漸成為傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。分子印跡聚合物的制備包括 3 個(gè)步驟:(1) 通過(guò)共價(jià)鍵或/和非共價(jià)鍵使模板或印跡分子(即待測(cè)分子)與功能單體形成官能團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的復(fù)合物 ,所用的功能單體須帶有能與印跡分子發(fā)生作用的功能基。常用的功能單體有丙烯酸、 甲基丙烯酸、 三氟甲基丙烯酸及苯乙烯等; (2) 加入交聯(lián)劑 ,在印跡分子-功能單體復(fù)合物周?chē)a(chǎn)生聚合反應(yīng) ,將官能團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的形式固定在聚合物中。常用的交

10、聯(lián)劑有:雙甲基丙烯酸乙二醇酯、 季戊四醇三丙烯酸酯及三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯等; (3) 從聚合物中除去模板 ,形成能特異識(shí)別、結(jié)合模板的空穴 ,這個(gè)聚合物即MIPs。是利用動(dòng)植物組織中的酶，特異性的催化底物，產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，引起基礎(chǔ)電極的響應(yīng)。第一支組織電極是用動(dòng)物組織牛肝在美Rechnitz實(shí)驗(yàn)室于1978年面世，1981年開(kāi)創(chuàng)了植物組織電極的研制。其工作原理類(lèi)似于酶?jìng)鞲衅?，是酶?jìng)鞲衅鞯难苌噪姌O 。組織傳感器的優(yōu)點(diǎn)：1、組織電極中酶活性比酶電極所用的離析酶的活性高 2、酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)。因?yàn)榻M織中的酶除了處于最適宜的環(huán)境，同時(shí)又相當(dāng)于被固定化了 3、組織電極用的生物材料，如動(dòng)物的肝，腎

11、，腸、肌肉，植物的葉、莖、花、果等易于獲得，可代替昂貴的酶試劑 4、不清楚是什么酶的催化反應(yīng)，或?qū)ι锎呋緩讲磺宄姆磻?yīng)系統(tǒng)，無(wú)法用酶電極，只有用組織電極 基本原理：免疫反應(yīng)。利用固定化抗體（或抗原）膜與相應(yīng)的抗原（或抗體）的特異反應(yīng)，使得生物敏感膜的電位發(fā)生變化?？乖蚩贵w一經(jīng)固定于膜上，就形成具有識(shí)別免疫反應(yīng)強(qiáng)烈的分子功能性膜。如，抗原在乙酰纖維素膜上進(jìn)行固定化，由于蛋白質(zhì)為雙極性電解質(zhì)，（正負(fù)電極極性隨值而變）所以抗原固定化膜具有表面電荷。其膜電位隨膜電荷要變化。故根據(jù)抗體膜電位的變化，可測(cè)知抗體的附量。免疫傳感器的結(jié)構(gòu)：2、根據(jù)傳感器輸出信號(hào)的產(chǎn)生方式分：生物親和型生物傳感器 、代謝

12、型生物傳感器、催化型生物傳感器是利用分子間特異的親和性，即生物活性物質(zhì)對(duì)底物的親和或鍵合作用而建立起來(lái)的，如免疫傳感器、受體傳感器和DNA傳感器等，根據(jù)生物反應(yīng)產(chǎn)生信息的物理或化學(xué)性質(zhì)，可采用電化學(xué)、光譜、熱、壓電和表面聲波等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。3、根據(jù)生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)化器分：電化學(xué)生物傳感器 （bioelectrode） 半導(dǎo)體生物傳感器（semiconductbiosensor） 測(cè)熱型生物傳感（calorimetricbiosensor） 測(cè)光型生物傳感器（opticalbiosensor） 壓電晶體生物傳感器（piezoelectricbiosensor） 利用壓電石英晶體對(duì)表面電極區(qū)附著

13、質(zhì)量的敏感性，并結(jié)合生物功能分子(如抗原和抗體)之間的選擇特異性，使壓電晶體表面產(chǎn)生微小的壓力變化，引起其振動(dòng)頻率改變可制成壓電生物傳感器 。它主要由壓電晶體、振蕩電路、差頻電路、頻率計(jì)數(shù)器及計(jì)算機(jī)等部分組成。常用壓電晶體材料：石英（SiO2）、鉭酸鋰（LiTaO3）晶體振動(dòng)兩種類(lèi)型：體聲波(bulk acoustic wave, BAW)表面聲波(Surface acoustic wave, SAW)食品工業(yè)中應(yīng)用ACB4.1 食品品質(zhì)檢測(cè)4.2 食品成分分析4.3 食品安全檢測(cè)4.1 食品品質(zhì)檢測(cè) 新鮮度檢測(cè) 例如 畜禽肉、魚(yú)肉和牛乳新鮮度的評(píng)定。 食品滋味及熟度的檢測(cè) 例如 醬鹵肉制品及

14、骨湯類(lèi)制品。4.1 食品品質(zhì)檢測(cè)例：畜禽肉生物傳感器 肉類(lèi)在腐敗過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種胺類(lèi),故測(cè)定胺類(lèi)也能反映肉類(lèi)的新鮮程度。 用腐胺氧化酶與過(guò)氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器,即肉鮮度傳感器,測(cè)定魚(yú)肉在貯藏過(guò)程上的鮮度,響應(yīng)時(shí)間40s,測(cè)定腐胺線性范圍為310-8310-6mol/L。 有些肉鮮度傳感器是通過(guò)測(cè)定葡萄糖濃度來(lái)評(píng)價(jià)肉類(lèi)食品的新鮮度。4.1 食品品質(zhì)檢測(cè)待分析物識(shí) 別 元 件化學(xué)變化 換能器可定量分析的電信號(hào)5核苷酸酶核苷磷酸化酶黃嘌呤氧化酶電化學(xué)元件氧電極 例：魚(yú)鮮度傳感器魚(yú)死后體內(nèi)ATPADP AMP IMP 肌苷次黃嘌呤尿酸4.1 食品品質(zhì)檢測(cè) 例：牛乳鮮度傳感器 牛乳鮮度傳感器實(shí)際

15、上是一個(gè)菌數(shù)測(cè)定儀。探頭是一種燃燒電池，它包括一個(gè)鉑陰極和一個(gè)Ag2O2陽(yáng)極，兩極間用陽(yáng)離子交換膜隔開(kāi)。被測(cè)定樣品與陽(yáng)極接觸，樣品中的細(xì)菌可在陽(yáng)極氧化，加入電子傳遞介質(zhì)，如亞甲基藍(lán)、二氯酚靛酚等可加快電極反應(yīng)速度，增大電流。電流值與樣品中的細(xì)菌濃度成比例，菌數(shù)越多，表明牛乳越不新鮮。牛乳放置過(guò)程中，受細(xì)菌作用而產(chǎn)生乳酸，因此乳酸含量可表示牛乳的鮮度. 此外，也可從牛乳放置過(guò)程脂解作用產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的含量來(lái)判斷牛乳及其制品的新鮮度。用于食品鮮度檢測(cè)以及微生物和生物毒素測(cè)定的傳感器類(lèi)型表1表24.2 食品成分分析 蛋白質(zhì)和氨基酸檢測(cè) 有機(jī)酸和醇類(lèi)物質(zhì)檢測(cè) 例如 乳酸、醋酸、乙醇、甲醇等。 糖含量

16、的檢測(cè) 例如 果汁、果醬、水果等含糖食品中葡萄糖含量。4.2 食品成分分析 例：乙醇生物傳感器 在與乙醇相關(guān)的食品成分分析中直接使用乙醇生物傳感器, 簡(jiǎn)便快捷, 結(jié)果準(zhǔn)確, 并且適用于現(xiàn)場(chǎng)在線分析。 天津商業(yè)大學(xué)利用核微孔酶膜制造乙醇生物傳感器已經(jīng)獲得了專(zhuān)利, 該技術(shù)既可以快速檢測(cè)乙醇又可以用于乙醇類(lèi)產(chǎn)品的發(fā)酵控制、質(zhì)量控制等, 無(wú)需很大的設(shè)備和廠房投資。4.2 食品成分分析例：蘋(píng)果成熟度（葡萄糖含量測(cè)定) 待分析物生 物 敏 感 膜 化學(xué)變化換能器可定量分析的電信號(hào)葡萄糖氧化酶膜電化學(xué)元件H2O2電極 4.3 食品安全檢測(cè)食品中微生物檢測(cè) 例如：沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌等。食品中生物

17、毒素檢測(cè) 例如：黃曲霉毒素殘留農(nóng)藥檢測(cè)食品添加劑的檢測(cè) 例如：甜蜜素、亞硝酸鹽、磷酸等。 4.3 食品安全檢測(cè) 食品中微生物的檢測(cè) 食品中病原性微生物的存在會(huì)給消費(fèi)者的健康帶來(lái)極大的危害，食品中毒素不僅種類(lèi)很多而且毒性大，大多有致癌、致畸、致突變作用，因此，加強(qiáng)對(duì)食品中的病原性微生物及毒素的檢測(cè)至關(guān)重要。4.3 食品安全檢測(cè)食品中微生物的檢測(cè) 食用牛肉很容易被大腸桿菌0157.H7.所感染，因此需要快速靈敏的方法來(lái)檢測(cè)和防御大腸桿菌0157.H7一類(lèi)的細(xì)菌。 Kramerr等人研究的光纖生物傳感器可以在幾分鐘內(nèi)檢測(cè)出食物中的病原體(如大腸桿菌0157.H7.)，而傳統(tǒng)的方法則需要幾天。這種生物

18、傳感器從檢測(cè)出病原體到從樣品中重新獲得病原體并使它在培養(yǎng)基上獨(dú)立生長(zhǎng)總共只需1天時(shí)間，而傳統(tǒng)方法需要4天。4.3 食品安全檢測(cè)食品中生物毒素的檢測(cè) 王飛報(bào)道了國(guó)外采用枯草桿菌制成的微生物傳感器對(duì)黃曲霉毒素B1的檢出限為0.8ug/ml。R.A.Ogert采用光纖傳感器測(cè)定了食品中的肉毒桿菌毒素A，檢測(cè)下限達(dá)5ng/mL，1min內(nèi)可完成測(cè)定。此外，應(yīng)用生物傳感器對(duì)蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素B、葡萄球菌毒素、沙蠶毒素的檢測(cè)也有報(bào)道。4.3 食品安全檢測(cè)殘留農(nóng)藥的檢測(cè) 目前，關(guān)于生物傳感器對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)報(bào)道較多，利用農(nóng)藥對(duì)目標(biāo)酶（如乙酰膽堿酯酶）活性的抑制作用研制的酶?jìng)鞲衅?，以及利用農(nóng)藥與特異性抗體

19、結(jié)合反應(yīng)研制的免疫傳感器，在食品殘留農(nóng)藥的檢測(cè)中得到廣泛的研究。4.3 食品安全檢測(cè)例：熟肉制品、泡菜等中亞硝酸鹽含量測(cè)定待分析物 識(shí)別元件光學(xué)變化換能器可定量分析的電信號(hào) 亞硝酸鹽還原酶光學(xué)元件 光纖第一代生物傳感器 (如葡萄糖傳感器 )由固定了生物成分的非活性基質(zhì)膜 (透析膜或反應(yīng)膜)和電化學(xué)電極所組成。 第二代生物傳感器 (如 SPR傳感器 )是將生物成分直接吸附或共價(jià)結(jié)合到轉(zhuǎn)換器的表面,而無(wú)需非活性的基質(zhì)膜,測(cè)定時(shí)不必向樣品中加入其他試劑?？贵w或受體蛋白作為分子識(shí)別組件。第三代生物傳感器 (如硅片與生命材料相結(jié)合制成的生物芯片)是把生物成分直接固定在電子元件上,它們可以直接感知和放大界

20、面物質(zhì)的變化 ,從而把生物識(shí)別和信號(hào)的轉(zhuǎn)換處理結(jié)合在一起,結(jié)構(gòu)更為緊湊。 生物傳感器具有選擇性好、快速、靈敏等特點(diǎn), 既可簡(jiǎn)單應(yīng)用于日常食品購(gòu)買(mǎi), 又可被生產(chǎn)者、檢測(cè)部門(mén)應(yīng)用于大規(guī)模食品檢測(cè)。維生素傳感器SBA-40型谷氨酸-葡萄糖雙功能分析儀進(jìn)樣帽位于反應(yīng)池上部?？梢詮拇颂幾⑷霕悠坊驑?biāo)準(zhǔn)液儀器處在隨時(shí)通電狀態(tài)，測(cè)定時(shí)按一下開(kāi)關(guān)發(fā)酵罐主機(jī)計(jì)算機(jī)SBA-60型生物傳感器乳酸在線分析系統(tǒng)一種葡萄糖傳感器-GlucowatchGlucose pulled through the skin by charged molecules The ions migrate to the anode (+) a

21、nd cathode (-) Glucose reacts with glucose oxidase to form hydrogen peroxideThe reaction produces an electrochemical measured by the AutoSensorSPR生物傳感器三個(gè)難點(diǎn)首先是如何高效地篩分出高活性的酶；其次是如何在工藝上將基膜做的盡可能的??；最后是如何改進(jìn)傳感器對(duì)應(yīng)用條件的適應(yīng)性和穩(wěn)定性。應(yīng)用范例快速分析葡萄糖、谷氨酸、乳酸鹽、乳糖、半乳糖等成分的多功能生物傳感器(2)測(cè)量大氣中乙醇、硫、胺、二氧化碳、二氧化氮和其他化學(xué)成分含量的電子鼻,它在食品與飲料制造業(yè)中已大量用于監(jiān)測(cè)有害微生物的污染程度以及各種食品的保鮮程度 (3)通過(guò)生物傳感器測(cè)量生物肌體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP) 的變化而實(shí)現(xiàn)了魚(yú)肉新鮮度快速測(cè)量未來(lái)趨勢(shì) 近年來(lái)，隨著生物科學(xué)、