SDS-PAGE教學(xué)資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。SDS生物學(xué)綜合實驗論文題目雙向電泳作者姓名學(xué)號所在院系生命科學(xué)學(xué)院學(xué)科專業(yè)名稱生物科學(xué)導(dǎo)師邵錦震論文完成時間2013年7月30日摘要：雙向電泳技術(shù)是分離大量蛋白質(zhì)組分的最有效的方法。1975年OFarrells首次建立了等電聚焦（IEF）及SDS-聚丙烯酰胺（SDS）雙向電泳技術(shù)(2-D)，并成功地分離約1000個E.coli蛋白。該方法依賴于蛋白質(zhì)的兩個重要特性：分子量和等電點。利用這一性質(zhì)首先通過毛細管聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦技術(shù)將不同等電點的蛋白質(zhì)分開，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將相同或相

2、近等電點而分子量不同的蛋白質(zhì)進行相對分子量分離。經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后,可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點和分子量信息。第一向IEF/SDS所用的聚丙烯酰胺凝膠通常為柱狀，第二向SDS所用的為板狀。IEF/SDS與IEF和SDS的區(qū)別在于：1.第一向的電泳分離系統(tǒng)與相應(yīng)的單向電泳不同。在進行第一向IEF時，為保證被分離的各種蛋白質(zhì)能夠充分地與SDS結(jié)合以利于第二向SDS的進一步分離，必須在第一向電泳系統(tǒng)內(nèi)加入高濃度的尿素和適量的的非離子去污劑NP-40，而且溶解蛋白質(zhì)樣品的溶液中除了加入這兩種試劑外還含有二硫蘇糖醇(DTT)。這些試劑本身并不帶電荷，不影響各蛋白質(zhì)原有的電荷量和等電點，其作用在于破壞

3、蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲梗瑥亩欣诘鞍踪|(zhì)分子在較為溫和的條件下與SDS充分結(jié)合。2.第二向的加樣操作與相應(yīng)的單向電泳不同。經(jīng)過第一向IEF，蛋白質(zhì)在第一向的凝膠柱內(nèi)得到了初步的分離。在進行第二向SDS-PAG時，其加樣方式是將第一向電泳后的凝膠柱包埋在第二向的凝膠板內(nèi)，通常包埋于凝膠板的上端。由于第二向的電泳分離系統(tǒng)不同于第一向，因此必須將第一向電泳后的凝膠柱在包埋于第二向凝膠板之前，預(yù)先在第二向的電泳分離系統(tǒng)內(nèi)進行震蕩平衡。所用的平衡液通常與單向SDS-PAG所用的蛋白質(zhì)樣品處理液相一致，內(nèi)含-巰基乙醇和SDS等。經(jīng)過震蕩平衡，凝膠柱內(nèi)原有的第一向分離系統(tǒng)被第二向的電

4、泳分離系統(tǒng)所取代。其中-巰基乙醇使蛋白質(zhì)組分分子的二硫鍵保持還原狀態(tài)，有利于SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，從而完成第二向SDS的樣品處理，即可進行第二向電泳。要使聚丙烯酰胺雙向電泳能夠得到較為精確的分離結(jié)果，組成雙向電泳的兩個單向電泳所依據(jù)的分離原理應(yīng)該有很大的不同。以蛋白質(zhì)混合組分得分離為例，如果兩個單向電泳所依據(jù)的分離原理相似，那么所得到的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離斑點基本呈對角線分布，這種分離結(jié)果并不比單向電泳分離優(yōu)越。雙向電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù),具有相吩簡便、快速、高分辨率和重復(fù)性等優(yōu)點。目錄1前言51.1第一向電泳等電聚焦IEF原理.51.2第二向電泳SDS

5、原理.62材料與方法62.1溶液與試劑72.1.1IEF試劑的配制.72.1.2SDS試劑的配制82.2實驗儀器122.3實驗方法132.3.1雙向電泳整個實驗流程132.3.2第一向電泳等電聚焦IEF152.3.3第二向電泳SDS163結(jié)果與分析193.1影響實驗結(jié)果的一些因素193.2催化反應(yīng)的條件.203.3注意事項214參考文獻22前言。IEF/SDS雙向電泳法是OFarrall和Klose分別在1975年根據(jù)不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立的。利用這一性質(zhì)首先通過毛細管聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦技術(shù)將不同等電點的蛋白質(zhì)分開，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將相同或相近等電點而分

6、子量不同的蛋白質(zhì)進行相對分子量分離。經(jīng)過二維電泳分離的蛋白質(zhì)在二維電泳圖譜所處的位置，就是該蛋白質(zhì)的相對分子量和等電點。1.1等電聚焦電泳（IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis）利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷），形成一個很窄的區(qū)帶pH梯度的組成pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前

7、兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當(dāng)移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點為pI2，也移向正極，由于pI2pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過一定時間后，具有不同等電點的兩性電解質(zhì)按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。理想的兩性電解質(zhì)

8、載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們

9、的等電點上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。均一膠和線性梯度膠1.2SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理：由于SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和巰基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽組分分成單個亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水

10、鍵打斷，因此它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們在水溶液中的形狀近似雪茄形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸改變則與蛋白質(zhì)的分子量成正比。基于上述2種情況，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是與橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)。進行SDS時，可利用已知分子量蛋白質(zhì)的電泳遷移率和分子量的對數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得分子量。2材料與方法2.1溶液與試劑2.1.1IEF溶液配制(1)覆蓋溶液（25mL/班）含8mol/L尿素，1%兩性電解質(zhì)pH3

11、9.5，5%(w/v)NP40(NonidetP40Substitute)和100mmol/LDTT.藥品成分質(zhì)量/體積尿素12g兩性電解質(zhì)(pH39.5)0.25mL10%的NP4012.5mLDTT0.386g重蒸水定容到25mL溶液不能受熱,儲存在冰箱中。(2)平衡溶液（250mL/班）Tris-HCl(pH6.8)緩沖液，含2%SDS，100mmol/LDTT和10%甘油藥品成分質(zhì)量/體積Tris-HCl(pH6.8)15mL10%SDS50mLDTT3.86g甘油29mL重蒸水定容到250mL室溫存放。(3)30%Acrylamide第一向儲液（100mL/班）含28.4%(w/v)

12、acrylamide和1.6%(w/v)N,N-methylene-bis-acrylamide用重蒸水先將bisacrylamide溶解后，再加入acrylamide，溶解，用重蒸水定容到100mL。藥品成分丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺超純水質(zhì)量/體積28.4g1.6g100ml如果溶液混濁，需要進行過濾。溶液存放在棕色瓶中，4C貯藏，34星期內(nèi)使用。(4)10%(w/v)NP40配制100mL溶液，稱量10gNP40，用重蒸水定容到100mL，室溫存放。(5)20mmol/LNaOH配制500mL，稱0.4gNaOH用蒸餾水定容到500mL。(6)10mmol/LH3PO4配制2000mL，量取

13、1.35mLH3PO4(85%)用蒸餾水定容到2000mL。(7)固定液藥品成分乙醇三氯乙酸磺基水楊酸蒸餾水質(zhì)量/體積35mL10g3.5g定容到100mL(8)脫色液藥品成分乙醇冰乙酸蒸餾水質(zhì)量/體積25mL10mL定容到100mL(9)10%過硫酸銨0.1g過硫酸銨溶于1mL重蒸水中，在4C冰箱中可保存34個星期。2.1.2SDS溶液配制。（1）30%聚丙烯酰胺貯液藥品成分丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺超純水質(zhì)量/體積150g4g500ml濾紙過濾后，棕色瓶4冰箱保存（2）1.5mol/LTris堿pH8.8藥品成分Tris堿超純水質(zhì)量/體積90.75g400ml用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8

14、，加超純水定容至500ml，4冰箱保存。（3）0.5mol/LTris堿pH6.8藥品成分Tris堿超純水質(zhì)量/體積12g120ml用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8，加超純水定容至200ml。4冰箱保存。（4）10%SDS藥品成分SDS超純水質(zhì)量/體積10g100ml混勻后，室溫保存。（5）10%Ap藥品成分Ap超純水質(zhì)量/體積0.1g1ml（用時加水溶解）溶解后，4冰箱保存（6）10電泳緩沖液（1=25mMTris，192mMglycine，0.1%SDS，pH8.3）藥品成分Tris堿甘氨酸SDS超純水質(zhì)量/體積30g144g10g1L混勻后，室溫保存（7）2SDS上樣緩沖液藥品成分質(zhì)量

15、/體積0.5MpH6.8Tris堿2.0ml10%SDS4.0ml甘油2.0ml1%溴酚藍0.05ml超純水定容至10mlDTT0.154g（用時現(xiàn)加）(8)固定液藥品成分乙醇冰醋酸蒸餾水質(zhì)量/體積50mL10mL定容至100mL(9)染色液藥品成分考馬斯亮藍R-250冰醋酸乙醇蒸餾水質(zhì)量/體積0.25g10mL40mL定容至100mL(10)SDS凝膠的配制表112%分離膠（15mL成分體積（mL）雙蒸水1.630%丙烯酰胺2.01.5MTris-Hcl(PH8.8)1.310%過硫酸銨（APs）0.0510%SDS0.05TEMED0.002表212%濃縮膠（5mL）。成分體積（mL）雙蒸

16、水1.430%丙烯酰胺0.331.5MTris-Hcl(PH6.8)0.2510%過硫酸銨（APs）0.0210%SDS0.02TEMED0.002(11).水化上樣緩沖液（=1*ROMANI）藥品成分濃度質(zhì)量/體積尿素8M4.805gCHAPS4%0.4gDTT65mM0.098g（現(xiàn)加）Bio-Lyte0.2%(w/v)50l（40%）（現(xiàn)加）溴酚藍0.001%10l（1%溴酚藍）超純水定容至10ml分裝成10小管，每小管1ml，-20冰箱保存。(12).低熔點瓊脂糖封膠液藥品成分濃度質(zhì)量/體積低熔點瓊脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%

17、1ml（10%SDS）溴酚藍0.001%100l（1%溴酚藍）超純水定容至100ml加熱溶解至澄清，室溫保存。2.2實驗儀器第一向電泳毛細管等電聚焦電泳（IEF）雙向電泳系統(tǒng)一套（見清單）燒杯1000mL、50mL各1個量筒1000mL（或500mL）、100mL、10mL各1個注射器1mL（帶長針頭）、微量注射器100L（或50L）各1支大塑料盒1個滴管1支電泳儀和垂直板電泳1掃描儀2.3實驗方法.2.3.1雙向電泳整個流程。植物材料研磨等預(yù)處理電泳加樣緩沖液提取蛋白質(zhì)樣本1.樣品制備2.凝膠制備IEF圓盤電泳SDS垂直板電泳3.上樣及電泳4.染色、脫色及后續(xù)處理染色,脫色掃描（照相）2.3

18、.2等電聚焦電泳(1)準(zhǔn)備玻璃管取4支18cm的長玻璃管，洗凈晾干。(2)配制第一向凝膠溶液（8mL/4組）配制方法見表1。(3)灌制第一向凝膠.取1支1mL注射器和一根長針頭，吸取約0.5mL第一向凝膠溶液，再取1支玻璃管，用手指墊一塊封口膜堵住玻璃管的一端，將長針頭全部插入玻璃管中，一邊注入凝膠溶液一邊后退針頭，注意針頭不要露出膠面,直至凝膠溶液到達玻璃管頂端，撤出針頭，用濾紙擦干玻璃管口的凝膠溶液，然后用封口膜封住該端管口，將玻璃管倒置，將長針頭從玻璃管的另一端插入管內(nèi)凝膠液面下，用同樣方法加入凝膠溶液至距管口2cm處，將玻璃管垂直放置，然后立即用微量注射器在膠面上加少量重蒸水覆蓋，大約

19、30min后凝膠聚合。(4)加樣待凝膠聚合后，用微量注射器吸去覆蓋在膠上的重蒸水。在每根膠柱上加2030L蛋白質(zhì)樣品溶液，然后再加入覆蓋溶液至管口。(5)安裝電泳槽加樣后將玻璃管插入電泳槽的架子上，在上槽中玻璃管上端露出1cm，剝?nèi)ゲＡЧ芟露说姆饪谀?，?zhǔn)備電泳。在電泳槽的下槽加2000mL10mmol/LH3PO4溶液，將柱膠下端浸入到H3PO4溶液中，注意膠下端不可有氣泡(如果有氣泡，可以先用注射器將膠下端用H3PO4溶液灌滿，再將柱膠插入H3PO4溶液中)。上槽倒入500mL20mmol/LNaOH溶液，蓋上電泳槽蓋，注意正負電極。(6)聚膠電泳在10001500V的電壓下進行電泳，直至電

20、流接近于為零(大約78h)停止電泳。如果聚焦好的凝膠不能馬上進行第二向電泳，在管內(nèi)放置了幾小時以上,可在走第二向電泳之前再聚焦電泳12h，以消除樣品受擴散的影響。(7)退膠電泳結(jié)束后，在整極端凝膠內(nèi)插入約1cm長的銅絲作為標(biāo)記，用洗耳球從玻璃管上樣端輕輕擠入空氣，將凝膠退膠或用10mL注射器和長針頭吸入一定的蒸餾水，將長針頭一邊沿管壁推入一邊注入蒸餾水使凝膠退出。（8）平衡:將推出的一條凝膠條放入盛有10ml平衡液的小燒杯中，浸泡平衡20min，然后進行第二向電泳.(9)染色:另一條膠放入固定液中固定12h，用考馬斯亮藍R250染色1h，再用脫色液脫色，觀察第一向聚焦效果。圓盤電泳示意圖2.3

21、.3SDS(1)組裝夾心式玻璃板、制膠支架底座調(diào)水平；取一塊長玻璃板和一塊帶磨口槽的短玻璃板，將短玻璃板帶磨口槽的一邊位于上端與長玻璃相對，兩玻璃板之間的左、右兩端各放入一條間隔條，對齊，插入玻璃板固定夾，將上面的固定螺絲擰緊，將此夾心式玻璃板放入制膠支架底座，插入凸輪，向內(nèi)側(cè)推入并旋轉(zhuǎn)180，夾心式玻璃板即被固定。(2)分離膠配制分離膠按照凝膠濃度不同分為三層，自下而上濃度遞減，每層高度約45cm，分別按照表2配制，并依次灌制。(3)灌注分離膠首先將配制的第一層凝膠溶液用滴管沿著長玻璃板內(nèi)側(cè)緩緩加入凝膠腔，小心不產(chǎn)生氣泡，然后用少量1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（高度約2mm），凝膠聚合大約

22、30min。待凝膠聚合后用濾紙片吸干封膠緩沖液，灌注第二層凝膠溶液，并封膠面。凝膠聚合后灌注第三層凝膠溶液，最終凝膠距離短玻璃板上沿3cm左右,最后用1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（約20mm）。4)配制和灌注濃縮膠用濾紙吸去分離膠上面封的分離膠緩沖液，然后加入濃縮膠溶液，插入樣品槽模板，凝膠溶液應(yīng)到達短玻璃板上沿，聚合0.51h。濃縮膠溶液配制方法見表3。(5)安裝第二向電泳裝置在冷卻槽上取下紅色密封條，安裝上白色密封條，將夾心式凝膠板從灌膠支架底座上取下，安裝在冷卻槽上。(6)凝膠拼接將平衡好的膠條用少量的電極緩沖液漂洗，擺放在一塊干凈的玻璃板上，膠條的正極端位于小加樣槽一端。膠條兩端各切

23、去約2cm，使凝膠長度略短于加樣槽；輕輕拔出樣品槽模板，在小加樣槽中加入510L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；用滴管將已加熱融化的用電極緩沖液配制的1瓊脂快速加在濃縮膠上，使瓊脂在濃縮膠上鋪開形成一層水平的膠層，瓊脂高度為12mm；待瓊脂凝固，將放著膠條的玻璃板靠近短板，使膠條滑入槽內(nèi)，平鋪在瓊脂上，將膠條與瓊脂膠緊密結(jié)合；用滴管加融化的瓊脂于膠條上，使到達短板上沿，將膠條包埋；滴加融化的瓊脂到玻璃板與冷卻槽交接處，密封上槽。(7)電泳將電泳裝置放入電泳槽中，在上槽中灌入電極緩沖液，緩沖液高過短板，其余緩沖液到入下槽，應(yīng)高過凝膠板下沿2cm。蓋上電泳槽蓋子，接通電源，恒壓60V，電泳30min，樣品進入凝膠后，

24、調(diào)節(jié)恒壓250V，電泳至溴酚蘭到達分離膠底部1cm左右時停止。(8)固定倒去電極緩沖液，拆開電泳槽，取下凝膠板，放入固定液中，室溫過夜。(9)染色和脫色用考馬斯亮藍R250染色液染色2h，用脫色液脫色，直至背景清晰。(10)實驗結(jié)果凝膠掃描。2.分離膠（Runninggel）凝膠濃度10-15%Tris-HCl:pH8.81.層積膠（Stackinggel）凝膠濃度5%Tris-HCl:pH6.8聚丙烯酰胺垂直板電泳：是在圓盤電泳的基礎(chǔ)上建立的，兩者電泳原理完全相同，只是灌膠的方式不同，凝膠不是灌在玻璃管中，而是灌在嵌入橡膠框凹槽中長度不同的2塊平行玻璃板的間隙內(nèi)。間隙可調(diào)節(jié)，一般有0.5mm

25、，1.5mm及3mm3種規(guī)格的橡膠框，前2種多用于分析鑒定，后一種常用于制備。垂直板電泳較圓盤電泳有更多的優(yōu)越性：（1）表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。（2）在同一塊膠板上，可同時進行10個以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。（3）膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。（4）膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。（5）可進行雙向電泳。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點（與其他凝膠相比）：凝膠化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)。凝膠孔徑大小可調(diào)節(jié)（根據(jù)被分離物的分子量，選擇合適的凝膠濃度；通過

26、改變單體及交聯(lián)劑的濃度，調(diào)節(jié)凝膠的孔徑）。分辨率高（尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而有更高的分辨率）。樣品用量少（樣品不易擴散，靈敏度可達10-6g）。樣品分離重復(fù)性好（高純度Acr，幾乎無電滲作用，操作條件一致）。凝膠透明，有彈性，機械性能好，便于操作。pH和溫度變化時，凝膠穩(wěn)定，便于保存。3結(jié)果分析。3.1影響實驗結(jié)果的一些因素。AP-TEMED：化學(xué)聚合作用。加速劑四甲基乙二胺(TEMED)的堿基可使催化劑過硫酸銨(簡稱AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活A(yù)cr單體，形成單體長鏈，在交聯(lián)劑Bis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。核黃素-TEMED：光聚合作用。光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能發(fā)生，因為核黃素在TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基