RealtimePCR簡介課件(PPT 90頁)

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與應(yīng)用北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司第1頁，共90頁。第2頁，共90頁。提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介：第3頁，共90頁。PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶鏈反應(yīng)是在體外選擇性的擴(kuò)增特定DNA片段的方法。第4頁，共90頁。PCR 循環(huán)第一步 加熱變性、雙鏈打開第二步退火、引物與單鏈結(jié)合第三步 - 引物延伸變?yōu)閮蓚€(gè)雙鏈DNA第5頁，共90頁。第6頁，共90頁。常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：理

2、論上PCR產(chǎn)物的積累是按照2n指數(shù)擴(kuò)增PCR后借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析DNA EngineS1 S2 M第7頁，共90頁。常規(guī)PCR常規(guī)PCR結(jié)合電泳分析方法的局限性 只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量對終產(chǎn)物分析，受PCR過程平臺效應(yīng)的干擾，定量準(zhǔn)確度難以提高（相對誤差1000%）存在擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題。必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)事而且EB有毒無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測第8頁，共90頁。提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡

3、介：第9頁，共90頁。定量PCR定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR儀第10頁，共90頁。定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR三個(gè)關(guān)鍵詞： 實(shí)時(shí)，熒光，定量 如何實(shí)時(shí)檢測？ 借助熒光物質(zhì)示蹤擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化第11頁，共90頁。PCR反應(yīng)混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)第12頁，共90頁。熒光曲線 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號，得到一條

4、熒光擴(kuò)增曲線圖第13頁，共90頁。定量原理 如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個(gè)概念： 熒光閾值、Ct值第14頁，共90頁。定量原理熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))閾值線第15頁，共90頁。Ct值的概念定量原理Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-閾值線第16頁，共90頁。濃度低濃度高模板起始濃度越高，Ct值越小定量原理CT值與模板起始濃度的關(guān)系哪個(gè)樣品濃度高？第17頁，共90頁。閾值選擇閾值的選擇熒光閾值是在熒光

5、擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上缺省設(shè)置一般是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮 第18頁，共90頁。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用Ct的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。 Ct值的重現(xiàn)性第19頁，共90頁。終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性 Ct值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖第20頁，共90頁。定量原理 理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0(1+Ex)n n：擴(kuò)

6、增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率第21頁，共90頁。在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct =N (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為N.方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得:logN=logX0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logX0= -log(1+Ex)*Ct+log N (3) Ct= -1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex) (4)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量定量原理第22頁

7、，共90頁。初始模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)（CT值)呈線性關(guān)系初始模板量越多, 擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少確定初始模板的濃度定量原理第23頁，共90頁。Absolute（絕對定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Relative（相對定量）Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a st

8、andard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法 第24頁，共90頁。 定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過未知樣品的Ct值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始濃度。 絕對定量熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線.未知10410310610510210第25頁，共90頁。首先確定未知樣品的 C(t)值 借助標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始

9、量絕對值unknown104103Unknown contains 3108 copies絕對定量第26頁，共90頁。相對定量相對定量CT 法 未進(jìn)行歸一化經(jīng)過校正CT法 校正加入反應(yīng)體系當(dāng)中模板量 通常使用內(nèi)參進(jìn)行校正 第27頁，共90頁。CTCT 認(rèn)為擴(kuò)增效率為100% 只能使用一個(gè)內(nèi)參進(jìn)行校正Pfaffl Modification 根據(jù)擴(kuò)增效率進(jìn)行分析 只能使用一個(gè)內(nèi)參進(jìn)行校正Vandesompele Method 根據(jù)擴(kuò)增效率進(jìn)行分析 可以使用多個(gè)內(nèi)參進(jìn)行校正SimpleComplex第28頁，共90頁。CTGOITissue #2:Tissue #1:2224Delta Ct:24-

10、22 = 2Fold induction = 22 = 4第29頁，共90頁。Livak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quantification1. Normalize C(t):C(t) = C(t)target - C(t)hskg2. Calculate C(t)Average:C(t)Ave = Average C(t) of replicates 3. Normalize to calibrator: C(t) = C(t)Sample Ave - C(t)Calibrator Ave(For calibrator, C(

11、t) = 0)4. Fold difference:F=2-C(t) = Normalized fold difference (For calibrator, 2-C(t) = 1)Note, this formula can be modified to account for reaction efficiencies (Dr. M. Pfaffl) and multiple reference genes (Dr. J. Vondosomple).相對定量 CT 第30頁，共90頁。ReferenceGOI21Tissue #2:Tissue #1:202224Delta Ct #2:

12、Delta Ct #1:22-21 = 124-20 = 41st DeltaDelta Ct:4-1 = 32nd DeltaFold induction = 23 = 8CT第31頁，共90頁。Relative QuantificationCtStarting quantity90%2422Problem with the CT第32頁，共90頁。Ct90%2422100%Starting quantityRelative QuantificationCT缺陷斜率不一樣第33頁，共90頁。Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fol

13、d induction = Efficiencyreference deltaCt reference (control-sample)Efficiency = 10-1/slope(Pfaffl, 2001; Nucleic Acid Research)Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fold induction = Efficiencyreference deltaCt reference (control-sample)Relative Quantification Pfaffl第34頁，共90頁。Primer set #1

14、ReferencePrimer set #2 GOI21Tissue #2:Tissue #1:20222490% = 1.9Delta Ct:Efficiency:20-21 = -1100% = 224-22 = 22target deltaCt target (24-22 = 2)Fold induction = 1.9reference deltaCt reference (20-21 = -1)= 40.53= 7.50.537.5(From Standard curve)Relative Quantification Pfaffl Modification第35頁，共90頁。 DC

15、t 方法: (沒有內(nèi)參)表達(dá)倍數(shù) : 4 DDCt 方法: (有內(nèi)參)表達(dá)倍數(shù) : 8Pfaffl 修正: (內(nèi)參+效率)表達(dá)倍數(shù) : 7.5方法比較第36頁，共90頁。與傳統(tǒng)PCR的比較實(shí)現(xiàn)了初始模板的絕對定量檢測靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對初始模板含量差異較大的樣品同時(shí)定量省時(shí)省力檢測設(shè)計(jì)靈活第37頁，共90頁。提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介：第38頁，共90頁。 SYBR Green 1 Molecular Beaco

16、ns TaqMan熒光化學(xué)第39頁，共90頁。SYBR Green ISYBR Green 1第40頁，共90頁。SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第41頁，共90頁。SYBR Green I 工作原理Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBD

17、BDBDBDlllll第42頁，共90頁。SYBR Green I 工作原理第43頁，共90頁。SYBR Green I 優(yōu)點(diǎn) 使用方便 - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏第44頁，共90頁。SYBR Green I 缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合無法實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因的檢測第45頁，共90頁。關(guān)于SYBR Green I一種最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)手段評價(jià)引物特異性： 使用熔點(diǎn)曲線分析（ Melt Curve Analysis） 評價(jià)引物對擴(kuò)增效率： 將模板進(jìn)行梯度稀釋研究最適反應(yīng)條件： 使用梯度功能進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件第46頁，共90頁。Molecular Beacon

18、sMolecular Beacons發(fā)夾型雜交探針第47頁，共90頁。Molecular Beacons原理：熒光偏振能量傳遞（FRET） 莖由互補(bǔ)配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對莖熒光素淬滅劑環(huán)第48頁，共90頁。變性: 產(chǎn)生非特異性的熒光Molecular Beacons第49頁，共90頁。Target-loop interaction more stable than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火時(shí):探針與靶序列結(jié)合熒光素與淬滅劑分離發(fā)出熒光（靶序列特異的）Molecular Beacons 第50頁，

19、共90頁。延伸: 沒有熒光Molecular Beacons SNP第51頁，共90頁。Molecular Beacons 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第52頁，共90頁。Molecular Beacons 優(yōu)點(diǎn) 對目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一 可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測 熒光背景低第53頁，共90頁。Molecular Beacons缺點(diǎn) 設(shè)計(jì)困難 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo) 價(jià)格較高 第54頁，共90頁。TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第55頁，共90頁。TaqMan 目標(biāo)特異性探針 5為熒光素， 3為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)第56頁，共90頁。5533d.

20、NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqMan工作原理第57頁，共90頁。535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lTaqMan工作原理

21、R3Q第58頁，共90頁。TaqMan實(shí)驗(yàn)結(jié)果第59頁，共90頁。TaqMan優(yōu)點(diǎn) 對目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測 與 Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì) 相對簡單第60頁，共90頁。TaqMan缺點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 背景高第61頁，共90頁。兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5-3外切）延伸復(fù)性任何步驟定量和檢測目標(biāo)基因熔解曲線分析SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因SNP分析定量和檢測目標(biāo)基因信號檢測工作原理有否淬滅劑化學(xué)試劑否有有主要應(yīng)用范圍第62頁，共90頁。提綱 PCR簡

22、介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介：第63頁，共90頁。多重PCR在一個(gè)PCR管中進(jìn)行多個(gè)不同的PCR反應(yīng)： 同一樣本，多對引物，分別擴(kuò)增不同的靶基因 目標(biāo)基因 內(nèi)參照基因（看家基因）不同熒光標(biāo)記的探針識別不同的靶基因第64頁，共90頁。內(nèi)參照基因 解決模板提取過程中造成的差別 解決樣品材料不均一造成的差別 解決加樣過程中的差別內(nèi)參照基因第65頁，共90頁。多通道技術(shù)多通道技術(shù)：使用多種熒光染料在不同的檢測通道內(nèi)同時(shí)測定多種不同熒光染料發(fā)出的熒光第66頁，共90頁。1、引物及探

23、針問題-引物及探針的相互干擾2、不同PCR反應(yīng)要在同樣擴(kuò)增條件下進(jìn)行2、模板量差別-共用資源的相互競爭多重PCR技術(shù)問題一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增要解決的問題：第67頁，共90頁。FRRQFRRQFRRQRQ多重PCR技術(shù)問題1、引物及探針相互干擾問題第68頁，共90頁。FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2、共用資源的相互競爭多重PCR技術(shù)問題第69頁，共90頁。單雙通道同時(shí)進(jìn)行，相互驗(yàn)證FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ單單雙多重PCR技術(shù)問題第70頁，共90頁。提綱 PCR簡介

24、 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 熔解曲線分析 基因分型（SNP）檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介：第71頁，共90頁。Temperature increasesFluorescencedecreasesTm Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of

25、inflection on the melting curveSYBR Green I 融解曲線分析第72頁，共90頁。熒光強(qiáng)度值隨溫度變化速率對溫度作圖(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green I 融解曲線分析第73頁，共90頁。SYBR Green I 融解曲線分析10,000 copies非特異性產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物10 copies第74頁，共90頁。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線擴(kuò)增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5.

26、Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.SYBR Green I 融解曲線分析第75頁，共90頁。10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec

27、7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.擴(kuò)增曲線SYBR Green I 融解曲線分析第76頁，共90頁。 進(jìn)行可靠的定量實(shí)驗(yàn)需要對引物對進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì) 用于優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù) 引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)增片段選擇 試劑的濃度 循環(huán)條件 變性溫度和退火溫度Real-time PCR體系優(yōu)化第77頁，共90頁。利用動(dòng)態(tài)溫度梯度功能一次實(shí)現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化Real-time PCR體系優(yōu)化第78頁，共90頁。45oC55oC65oC

28、溶解曲線擴(kuò)增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.Real-time PCR體系優(yōu)化第79頁，共90頁。提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學(xué)物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 熔解曲線分析 基因分型（SNP）檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)簡介：第80頁，共90頁。FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific