分子生物學(xué)課件RNA的生物合成

1、4-1 概述4-2 RNA聚合酶4-3 啟動子4-4 終止子和終止因子4-5 RNA合成的調(diào)控4-6 轉(zhuǎn)錄后的加工第四章 RNA的生物合成4-1 概 述在由DNARNA蛋白質(zhì)的信息流中，RNA是中心環(huán)節(jié)。 RNA是已知的兼具遺傳信息和催化兩種功能的大分子。 一、DNA與RNA分子的異同點（1）RNA核糖2位置有羥基，且以尿嘧啶代替胸腺嘧啶； （2）大部分RNA分子是單鏈的，這些RNA往返折疊使RNA具有比DNA更多結(jié)構(gòu)上的多樣性，使RNA具有各種不同的生物功能。二、DNA復(fù)制與RNA合成的異同點相同點：（1）除了某些病毒RNA基因組外，所有RNA分子都是以DNA為模板（模板使用）。 （2）合成

2、方向也是由53方向（極性）。（3）合成的化學(xué)機制基本相同，根據(jù)堿基互補配對。（4）都有起始、延伸、終止三個階段。 不同點：（1）轉(zhuǎn)錄不需要引物。 （2）轉(zhuǎn)錄一般只涉及一個短的DNA序列片段；編碼鏈（即非模板鏈、正鏈、有意義鏈），模板鏈（即負鏈、無意義鏈） （3）轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶催化，與DNA上的特異序列啟動子結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄（復(fù)制是由DNA聚合酶開始，從復(fù)制起始點開始）。 （4）RNA合成不象DNA有校對機制(Proof reading) 。 （5） 轉(zhuǎn)錄時，DNA雙螺旋一段短距離范圍解螺旋形成轉(zhuǎn)錄泡(Bubble)，RNA在形成后不久被剝離模板。Coding strand of DNA h

3、as the same sequence as mRNA.Transcription is catalyzed by RNA polymerase4-2 RNA聚合酶一、RNA聚合酶催化反應(yīng) RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵酶，原核和真核生物的RNA聚合酶雖然都能催化RNA的合成，但在其分子組成、種類和生化特性上各有特色。激活RNA聚合酶的活性需要DNA，它以雙鏈DNA為模板時活性最強！ 4種NTPDNA指導(dǎo)的RNA聚合酶 DNA，Mg+或Mn+ RNA + ppiTranscription is catalyzed by RNA polymerase二、原核生物的RNA聚合酶加上亞基后則成為聚

4、合酶全酶（holoenzyme）相對分子量為4.65 105 。 E.coli的RNA聚合酶由五種亞基組成、 。2亞基組成核心酶；(一) 組成：亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合，催化磷酸二酯鍵形成。 （ 亞基為堿性蛋白質(zhì)，與酸性DNA之間可借靜電引力相結(jié)合； 亞基也可借疏水相互作用與DNA結(jié)合,它們在序列上與真核生物RNA聚合酶的兩個大亞基有同源性）、：由和亞基組成了聚合酶的催化中心。亞基：與核心酶的組裝及啟動子的識別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。亞基：功能還不清楚。(二) 功能：它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模板上的啟動子。亞基：因子可以極大地提高R

5、NA聚合酶對啟動區(qū)DNA序列的親和力，其作用是負責模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始。因子可使酶與底物結(jié)合常數(shù)提高103倍 ，時間可達數(shù)小時，還可以使酶與模板DNA上的非特異性位點的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底物復(fù)合無的半衰期小于1s。E.coli中RNA聚合酶50bp/s（37）；每個E.coli：細胞中約7000個 酶分子； 細菌的 m RNA、r RNA、t RNA、由同一種RNA聚合酶所轉(zhuǎn)錄。 在某些細菌細胞內(nèi)含有能識別不同啟動子的因子，以適應(yīng)不同生長發(fā)育階段的要求，調(diào)控不同基因轉(zhuǎn)錄的起始。在E.coli中最常見的調(diào)控因子是70，而32 是與熱休克啟動子所控制的基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，54 則參與細胞

6、的N代謝。Sigma factor is the subunit of bacterial RNA polymerase needed for initiation; is the major influence on selection of binding sites (promoters).（三）過程：三、真核生物的RNA聚合酶真核生物的基因組遠比原核生物大，它們的RNA聚合酶也要復(fù)雜。真核生物的RNA聚合酶有三類，相對分子量都在5 105左右，通常有8-14個亞基，并含有Zn2+ 。Alpha-amanitin (雙環(huán)八肽) isolated from Amanita phalloid

7、es （一）分類：RNA聚合酶 ：對-鵝膏蕈堿（ -amanitine ）不敏感；轉(zhuǎn)錄45s rRNA前體。RNA聚合酶 ：可被低濃度-鵝膏蕈堿（ 10-9-10-8 mol/L ）所抑制；轉(zhuǎn)錄所有編碼蛋白質(zhì)的基因和大多數(shù)核內(nèi)小 RNA（snRNA）。RNA聚合酶：只被高濃度-鵝膏蕈堿（ 10-5-10-4 mol/L ）所抑制；轉(zhuǎn)錄小的RNA基因，tRNA、5S rRNA 、 U6 snRNA、scRNA。（二）組成： 將提純的酵母RNA聚合酶進行凝膠電泳可分出10條明顯的條帶。最大的3個亞基分別相當于細菌RNA聚合酶、的同源物，化學(xué)計量測定它們之間的比例為2：1：1，它們擔負著RNA聚合酶

8、的基本功能 。 *真核生物RNA聚合酶中沒有細菌因子的對應(yīng)物，因此必須借助各種轉(zhuǎn)錄因子才能選擇和結(jié)合到啟動子上。 轉(zhuǎn)錄過程與細菌不同的是真核生物RNA聚合酶自身不能識別和結(jié)合到啟動子上，而需要在啟動子上由轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶裝配成活性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物才能起始轉(zhuǎn)錄。 （三）過程：真核生物的轉(zhuǎn)錄過程分為裝配、起始、延伸和終止4個階段，其間各種因子的作用比細菌的復(fù)雜得多。4-3 啟動子（promoter）一、啟動子的基本結(jié)構(gòu)啟動子：是指RNA聚合酶識別，結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄單元（transcriotion unit）：是一段從啟動子開始至終止子（terminator）結(jié)束的DNA序列。轉(zhuǎn)

9、錄起點：是指新生RNA鏈第一個核苷酸相對應(yīng)的DNA鏈上的堿基，研究證實通常為一個嘌呤。Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription.轉(zhuǎn)錄上游（upstream）：常指起點前面5末端的序列； (用-1，-2，-3表示)轉(zhuǎn)錄下游（downstream）：常指起點后面3末端的序列；(用+1，+2，+3表示)換句話講，從轉(zhuǎn)錄起點沿RNA聚合酶運動方向稱為下游，而反方向為上游，在描述堿基的位置時，一般用數(shù)字表示，起點為+1，下游方向依次為+2、+3 ，上游方向依次為-

10、1、-2、-3 二、原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)特點足跡分析法(footprint）足跡分析法是pribnow 設(shè)計的一個實驗與DNA測序技術(shù)相結(jié)合。是確定啟動子的序列結(jié)構(gòu)的方法。 所謂足跡法既是將DNA起始轉(zhuǎn)錄的限制片段分離出來。加RNA聚合酶使之結(jié)合。再用DNA酶部分水解。與酶結(jié)合的部位被保護而不水解，其余部位水解成長短不同的片段，經(jīng)凝膠電泳即可測出酶所結(jié)合的部位。大腸桿菌RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄起始階段縮短覆蓋DNA的長度啟動子共有序列的功能上游區(qū)有兩個共有序列：Pribnow區(qū)：又稱-10區(qū)（TATAAT），有助于DNA局部雙鏈解開。35序列：又稱識別區(qū)（TTGACA），提供了RNA聚合酶識別信號。

11、啟動子結(jié)構(gòu)是不對稱的，它決定了轉(zhuǎn)錄的方向。三、真核生物啟動子（一）分類：1. RNA聚合酶的啟動子：核心啟動子（-45+20）；上游控制元件（UCE，-180 -107 ）真核生物的啟動子由轉(zhuǎn)錄因子識別，而不是RNA聚合酶所識別，多種轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶在起點上形成前起始復(fù)合物（preintiation complex）而促進轉(zhuǎn)錄。2. RNA聚合酶的啟動子： 5S rRNA 和tRNA以及胞質(zhì)小RNA（scRNA）基因的啟動子位于轉(zhuǎn)錄起點下游，即基因內(nèi)部。核內(nèi)小RNA基因啟動子在轉(zhuǎn)錄起點上游。3. RNA聚合酶的啟動子class 啟動子涉及眾多編碼蛋白質(zhì)的基因表達控制。包括以下幾類控制元件

12、：ModuleConsnesusDNA boundFactorTATA boxTATAAAA10bpTBPCAAT boxGGCCAATCT22bpCTF/NF1GC boxGGGCGG20bpSP1OctamerATTTGCAT20bpOct-1OctamerATTTGCAT23bpOct-2kBGGGACTTTCC10bpNF kBATFGTGACGT20bpATFTATA boxCAAT boxGC boxOctInrGoldberg-HegnessInr:位于轉(zhuǎn)錄起始點的起始子（initiator,Inr），可用同式Py2ANPy5表示之。TATA區(qū):位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25 -30b

13、p處的共有序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。CAAT區(qū):起始點上游-70 -78bp處另一段共有序列GGCCAATCT，稱為CAAT區(qū)。GC區(qū):起始點上游-80 -110bp處含有GCCACACCC或GGGCGGG 序列，稱為GC區(qū)。增強子:起始點上游-100bp以上處含有72bp長的重復(fù)序列，稱為增強子（enhancer）。RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的裝配4-4 終止子和終止因子一、基本概念終止子（terminator） ：模板DNA上存在終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號 終止因子（termination factor）：協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質(zhì)），稱為終止因子。 通讀（re

14、adthrough）：有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，稱通讀。 抗終止因子（antitermination factor）：這種引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子。Terminator is a sequence of DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription.二、終止子的種類所有原核生物的終止子在終止點之前均有一個回文結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生的RNA可形成有莖、環(huán)構(gòu)成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 （一）簡單終止子（即不依賴于因

15、子的終止子） 1.終止子上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)； 2.在終止位點前面有一段由4-8個A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的3端為寡聚U，可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。 終止子效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，隨著發(fā)卡結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個U）長度的增加，終止效率逐步提高。（二）依賴于因子的終止子 依賴于因子的終止子必需在因子存在時才發(fā)生終止作用。 1. 依賴于因子的終止子其回文結(jié)構(gòu)中不富含GC區(qū)； 2.回文結(jié)構(gòu)之后也無寡聚U序列 .依賴于因子的終止子在細菌染色體中少見，而在噬菌體中廣泛存在。 三、終止因子 1因子

16、： 它通過催化NTP的水解使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。 2.NusA蛋白 NusA蛋白是一種可以與RNA聚合酶結(jié)合的識別終止子的特殊輔助因子。（nus位點包括NusA NusB NusG等 ） NusA因子可以提高終止效率，可能是由于它能促進RNA聚合酶在終止位置上的停頓。NusA蛋白可以與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，形成2NusA復(fù)合物。 轉(zhuǎn)錄終止后，RNA聚合酶脫離模板，NusA又被因子所取代。 四、抗終止抗終止作用主要見于某些噬菌體的時序控制。前早期基因N 蛋白晚早期基因表達抗終止表達Q 蛋白抗終止晚期基因表達由于不同生理要求，在轉(zhuǎn)錄過程中有時即使遇到終止信號，

17、仍然需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，即為抗終止作用。（一）抗終止過程（通讀）（二）抗終止作用主要有兩種方式：1.破壞終止位點RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu) 例如某些控制氨基酸的操縱子基因的轉(zhuǎn)錄受氨基酸濃度的高低控制。當濃度低時，破壞終止位點RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，抗終止；當濃度正常時，mRNA形成正常的二級結(jié)構(gòu)，其中包括末端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，RNA正常轉(zhuǎn)錄。2.依賴于蛋白質(zhì)因子的抗終止作用例如噬菌體中由N基因編碼產(chǎn)生的N蛋白具有抗轉(zhuǎn)錄終止的作用。其功能的發(fā)揮依賴于寄主所產(chǎn)生的NusA 、 NusB、S10等幾種蛋白質(zhì)。 NusA因子由N蛋白的研究而得名，其為酸性多肽，可以與N蛋白結(jié)合，也可與RNA聚合酶結(jié)合，改變其構(gòu)象，使之對終止子不敏

18、感?？梢奛usA對RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄速度和終止都有肯定的作用，說明它在調(diào)解因子之間起中介作用。 五、真核生物的轉(zhuǎn)錄終止信號 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是在3末端切斷，然后腺苷酸化，并無明顯的終止作用。 RNA聚合酶、 ，轉(zhuǎn)錄末端有一段連續(xù)的U，但不足以成為終止信號。很可能是與U前后的富含G、C序列及polyT是真核生物RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止信號。4-5 轉(zhuǎn)錄后的加工一、原核生物中RNA轉(zhuǎn)錄后的加工（post-transcriptional processing） 在原核生物中，rRNA、tRNA（部分）組成混合操縱子，某些tRNA簇與編碼蛋白質(zhì)的基因組成操縱子它們形成的多順反子轉(zhuǎn)錄物，經(jīng)斷裂形成r

19、RNA和tRNA的前體，然后進一步加工成熟。 （一）原核生物中rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工RNase IIIRNaseERNase III是一種負責RNA加工的核酸內(nèi)切酶，它的識別部位RNA為特定的RNA雙螺旋區(qū)，切割產(chǎn)生16S rRNA、23S rRNA前體。 5S rRNA在RNaseE作用下產(chǎn)生原核生物rRNA含有多個甲基修飾成分，包括甲基堿基和甲基核糖 兩端的多余附加序列需要進一步由核苷酸酶切除。 （二）原核生物中tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工 1. 由核酸內(nèi)切酶在tRNA兩端切斷：RNase P切5端，RNase F切3端。（二）原核生物中tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工2. 由核酸外切酶進一步進行修剪，從前體3

20、端逐個切附加序列，直到tRNA 3 端。3. 在tRNA 3 端加上CCA-OH，此反應(yīng)是由tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化進行，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸。 4. 核苷酸的修飾及異構(gòu)化，包括甲基化和假尿嘧啶核苷。tRNA + S-腺苷蛋氨酸（SAM） 甲基- tRNA + S-腺苷高半光氨酸 RNase P是一種很特殊的酶，含有蛋白質(zhì)和RNA兩部分，在某些條件下，RNase P中的RNA（M1RNA）單獨也能切斷tRNA前體的5端序列。二 真核生物中RNA轉(zhuǎn)錄后的加工hnRNA鏈長約是mRNA的45倍。 )含有內(nèi)含子序列的最初轉(zhuǎn)錄物，即mRNA前體，在核內(nèi)加工過程中形成分子大小不等的中間物，

21、被稱為核內(nèi)不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA） (一)hnRNA的加工1. hnRNA對哺乳動物來說大約有25%的hnRNA經(jīng)加工轉(zhuǎn)變成mRNA 。 . hnRNA的加工過程（1）5端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)（ m7G5pppNmpNp_）（2）3端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化（3）mRNA的內(nèi)部甲基化（4）通過拼接出去內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列（1）5端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)（ m7G5pppNmpNp_）pppN1pN2pRNA RNA三磷酸酶ppN1pN2pRNA + pi ppN1pN2pRNA mRNA鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶 +ppi G5pppN1pN2pRNA +GTP G5

22、pppN1pN2pRNA +SAM m7G5pppN1pN2pRNA mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶 +S-腺苷高半光氨酸 m7G5pppN1pN2pRNA +SAM 甲基轉(zhuǎn)移酶 m7G5pppNmpN2p-RNA +S-腺苷高半光氨酸 （2）3端的產(chǎn)生和多聚腺苷酸化高等真核生物細胞和病毒mRNA在靠近3端都有一段保守序列AAUAAA，這一段序列為鏈的切斷和多聚腺苷酸化提供了某種信號。 PolyA由多聚腺苷酸聚合酶所催化。 RNA為受體，ATP為供體，需要Mg2+或Mn2+及蛋白質(zhì)參與作用。 PolyA尾巴可能起到緩沖作用，防止核酸外切酶對hnRNA信息序列的降解作用。 （3）mRNA的內(nèi)部甲基化主要m6

23、A（N6-甲基腺嘌呤），它可能對mRNA前體的加工起識別作用。 （4）通過拼接出去內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄序列大多數(shù)真核基因為斷裂基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要拼接，去內(nèi)含子序列，使編碼區(qū)成為連續(xù)序列。 三、RNA的拼接（splicing） （一）RNA拼接的4種方式（分子內(nèi)）類型I的自我拼接（group I self-splicing）類型II的自我拼接（group II self-splicing）hnRNA的拼接tRNA的拼接1.類型I的自我拼接（group I self-splicing） 1981年，Cech在研究四膜蟲rRNA前體拼接過程中發(fā)現(xiàn)的。它可以自我催化完成。 此拼接只需1+、2+陽離子以及鳥苷酸

24、（或鳥苷）存在即可自發(fā)進行，無需能量及蛋白酶的催化，實際是磷酸酯的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。類型I的自我拼接的內(nèi)含子分布廣泛，出現(xiàn)在線粒體、葉綠體編碼的rRNA、tRNA、 mRNA的基因中；低等真核生物的rRNA基因。 .類型II的自我拼接（group II self-splicing）類型II內(nèi)含子本身也具有催化功能，能夠自我完成拼接。 經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)酯，內(nèi)含子成為套索（lariat）結(jié)構(gòu)被切除，兩個外顯子可以連接在一起。 轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無需游離的鳥苷酸發(fā)動，而是由內(nèi)含子靠3末端的腺苷酸2-OH攻擊5端磷酸基引發(fā)的。 類型II內(nèi)含子只見于某些真菌線粒體和植物葉綠體中。 核mRNA的（hnRNA）拼接體的拼接（nuc

25、lear mRNA spliceosomal） 真核生物的mRNA初始轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)的第三類內(nèi)含子也是最大的一類的內(nèi)含子。通過同樣的套索機制進行剪接，剪接需要特殊的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用。 GT-AG規(guī)則 ：這類內(nèi)含子的左端（5端）均為GT，右端（3端）均為AG（對應(yīng)于RNA為GU-AG） 拼接體（spliceosome）：在被拼接的RNA上，由上述5種U系列snRNA （U1、U2、U4、 U5、U6）和約50種蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物（5060S），呈有突起的橢球體。 核內(nèi)tRNA前體的酶促拼接 酵母tRNA前體的拼接需要ATP和一個內(nèi)切核酸酶。 反應(yīng)分為兩步進行：（1）由一個特殊的核酸內(nèi)切

26、酶斷裂磷酸二酯鍵，切除插入序列，反應(yīng)不需要ATP。 （2）由RNA連接酶催化使切開的tRNA兩部分共價連接。反應(yīng)需要ATP（植物、酵母類）。 生物體存在分子間的拼接，即反式拼接。（二）反式拼接與選擇拼接（trans-splicing and alternative-splicing） 1. 反式拼接（trans-splicing） 如果一個分子具有5拼接點，另一個分子具有3拼接點，它們又靠得很近，就可以發(fā)生反式拼接（如錐蟲的眾多mRNA）。 一個基因的轉(zhuǎn)錄物在不同的發(fā)育階段，分化細胞和生理狀態(tài)下，通過不同的拼接方式，可以得到不同的mRNA和翻譯產(chǎn)物，稱為選擇性拼接。所產(chǎn)生的多種蛋白質(zhì)即為同源體

27、（isoform）。2.選擇拼接（alternative splicing）現(xiàn)以降鈣素的mRNA前體為例，說明選擇拼接的機制。 （三） RNA拼接的生物學(xué)意義1.RNA拼接是生物機體的進化歷史形成的，是進化的結(jié)果。3.從內(nèi)含子的拼接方式和分布可以大致推測其起源時間。2.RNA拼接是基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。4.拼接促進有益重組，對生物機體進化十分重要。5.內(nèi)含子和外顯子是相對的，有些內(nèi)含子可以編碼序列，能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)或功能RNA，不能將內(nèi)含子看成是無用序列，因此，拼接過程是必要的。 四、RNA的編輯（RNA editing）是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變，這種改變mRNA編碼序列的方式，叫RNA的編輯。經(jīng)過編輯的mRNA序