RealtimePCR簡介課件

1、實時熒光定量PCR技術(shù)與應用北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶鏈反應是在體外選擇性的擴增特定DNA片段的方法。PCR 循環(huán)第一步 加熱變性、雙鏈打開第二步退火、引物與單鏈結(jié)合第三步 - 引物延伸變?yōu)閮蓚€雙鏈DNA常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術(shù)：理論上PCR產(chǎn)物的積累是按照2n指數(shù)擴增PCR后借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行定量及定性分析DNA Engin

2、eS1 S2 M常規(guī)PCR常規(guī)PCR結(jié)合電泳分析方法的局限性 只能對終產(chǎn)物進行分析，無法對起始模板準確定量對終產(chǎn)物分析，受PCR過程平臺效應的干擾，定量準確度難以提高（相對誤差1000%）存在擴增產(chǎn)物的污染問題。必須在擴增反應結(jié)束后借助電泳方法分析，費時費事而且EB有毒無法對擴增反應實時檢測提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：定量PCR定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析

3、IQ5 Real-time PCR儀定量PCR 實時熒光定量PCR三個關(guān)鍵詞： 實時，熒光，定量 如何實時檢測？ 借助熒光物質(zhì)示蹤擴增產(chǎn)物量的變化PCR反應混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)熒光曲線 隨著PCR反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖定量原理 如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個概念： 熒光閾值、Ct值定量原理熒光閾值在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準)閾值線Ct

4、值的概念定量原理Ct值的定義是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物(熒光信號）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-閾值線濃度低濃度高模板起始濃度越高，Ct值越小定量原理CT值與模板起始濃度的關(guān)系哪個樣品濃度高？閾值選擇閾值的選擇熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在指數(shù)擴增階段任意位置上缺省設置一般是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。但實際應用時要結(jié)合擴增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮 實時熒光定量PCR方法利用Ct的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進行檢測，此時樣品間的細小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復性。 Ct值的重現(xiàn)性

5、終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性 Ct值的重現(xiàn)性相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復96次擴增的擴增曲線圖定量原理 理想的PCR反應： X=X0*2n 非理想的PCR反應： X=X0(1+Ex)n n：擴增反應的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct =N (1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量. 在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為N.方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logN=logX0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logX0= -log(1+Ex)*Ct+log

6、N (3) Ct= -1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex) (4)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量定量原理初始模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)（CT值)呈線性關(guān)系初始模板量越多, 擴增產(chǎn)物達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少確定初始模板的濃度定量原理Absolute（絕對定量）Determines input quantity of a nucleic acid targetRequires a standard curve Relative（相對定量）Determines fold differences in inp

7、ut target nucleic acid quantities between samplesPerformed with or without a standard curveTypically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene14500 copies定量方法 定量原理：利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品作出標準曲線,通過未知樣品的Ct值,從標準曲線上計算出該樣品的起始濃度。 絕對定量熒光強度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標準曲線.未知1041031

8、0610510210首先確定未知樣品的 C(t)值 借助標準曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對值unknown104103Unknown contains 3108 copies絕對定量相對定量相對定量CT 法 未進行歸一化經(jīng)過校正CT法 校正加入反應體系當中模板量 通常使用內(nèi)參進行校正 CTCT 認為擴增效率為100% 只能使用一個內(nèi)參進行校正Pfaffl Modification 根據(jù)擴增效率進行分析 只能使用一個內(nèi)參進行校正Vandesompele Method 根據(jù)擴增效率進行分析 可以使用多個內(nèi)參進行校正SimpleComplexCTGOITissue #

9、2:Tissue #1:2224Delta Ct:24-22 = 2Fold induction = 22 = 4Livak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quantification1. Normalize C(t):C(t) = C(t)target - C(t)hskg2. Calculate C(t)Average:C(t)Ave = Average C(t) of replicates 3. Normalize to calibrator: C(t) = C(t)Sample Ave - C(t)Calibrator Ave(

10、For calibrator, C(t) = 0)4. Fold difference:F=2-C(t) = Normalized fold difference (For calibrator, 2-C(t) = 1)Note, this formula can be modified to account for reaction efficiencies (Dr. M. Pfaffl) and multiple reference genes (Dr. J. Vondosomple).相對定量 CT ReferenceGOI21Tissue #2:Tissue #1:202224Delt

11、a Ct #2:Delta Ct #1:22-21 = 124-20 = 41st DeltaDelta Ct:4-1 = 32nd DeltaFold induction = 23 = 8CTRelative QuantificationCtStarting quantity90%2422Problem with the CTCt90%2422100%Starting quantityRelative QuantificationCT缺陷斜率不一樣Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fold induction = Efficien

12、cyreference deltaCt reference (control-sample)Efficiency = 10-1/slope(Pfaffl, 2001; Nucleic Acid Research)Efficiencytarget deltaCt target (control-sample)Fold induction = Efficiencyreference deltaCt reference (control-sample)Relative Quantification PfafflPrimer set #1ReferencePrimer set #2 GOI21Tiss

13、ue #2:Tissue #1:20222490% = 1.9Delta Ct:Efficiency:20-21 = -1100% = 224-22 = 22target deltaCt target (24-22 = 2)Fold induction = 1.9reference deltaCt reference (20-21 = -1)= 40.53= 7.50.537.5(From Standard curve)Relative Quantification Pfaffl Modification DCt 方法: (沒有內(nèi)參)表達倍數(shù) : 4 DDCt 方法: (有內(nèi)參)表達倍數(shù) :

14、8Pfaffl 修正: (內(nèi)參+效率)表達倍數(shù) : 7.5方法比較與傳統(tǒng)PCR的比較實現(xiàn)了初始模板的絕對定量檢測靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對初始模板含量差異較大的樣品同時定量省時省力檢測設計靈活提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實時熒光定量PCR技術(shù)簡介： SYBR Green 1 Molecular Beacons TaqMan熒光化學SYBR Green ISYBR Green 1SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 結(jié)合到雙

15、鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green I 工作原理Extension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllSYBR Green I 工作原理SYBR Green I 優(yōu)點 使用方便 - 不必設計復雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏SYBR Green I 缺

16、點與非特異性產(chǎn)物結(jié)合無法實現(xiàn)多個目的基因的檢測關(guān)于SYBR Green I一種最基礎的實驗手段評價引物特異性： 使用熔點曲線分析（ Melt Curve Analysis） 評價引物對擴增效率： 將模板進行梯度稀釋研究最適反應條件： 使用梯度功能進一步優(yōu)化實驗條件Molecular BeaconsMolecular Beacons發(fā)夾型雜交探針Molecular Beacons原理：熒光偏振能量傳遞（FRET） 莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標序列完全配對莖熒光素淬滅劑環(huán)變性: 產(chǎn)生非特異性的熒光Molecular BeaconsTarget-loop interaction more stab

17、le than stem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火時:探針與靶序列結(jié)合熒光素與淬滅劑分離發(fā)出熒光（靶序列特異的）Molecular Beacons 延伸: 沒有熒光Molecular Beacons SNPMolecular Beacons 實驗結(jié)果Molecular Beacons 優(yōu)點 對目標序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一 可以實現(xiàn)多通道檢測 熒光背景低Molecular Beacons缺點 設計困難 只能用于一個特定的目標 價格較高 TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針T

18、aqMan 目標特異性探針 5為熒光素， 3為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標序列互補5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation535353535353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqMan工作原理535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53Q

19、TaqR354. Detection533QTaqR5lTaqMan工作原理R3QTaqMan實驗結(jié)果TaqMan優(yōu)點 對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測可以實現(xiàn)多通道檢測 與 Molecular Beacons 相比設計 相對簡單TaqMan缺點 價格較高 只適合于一個特定的目標 不能進行融解曲線分析 背景高兼容化學試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針水解型雜交探針（5-3外切）延伸復性任何步驟定量和檢測目標基因熔解曲線分析SNP分析定量和檢測目標基因SNP分析定量和檢測目標基因信號檢測工作原理有否淬滅劑化學試劑否有有主要應用范圍提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原

20、理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因 定量PCR技術(shù)延伸 基因分型（SNP）檢測 熔解曲線分析實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：多重PCR在一個PCR管中進行多個不同的PCR反應： 同一樣本，多對引物，分別擴增不同的靶基因 目標基因 內(nèi)參照基因（看家基因）不同熒光標記的探針識別不同的靶基因內(nèi)參照基因 解決模板提取過程中造成的差別 解決樣品材料不均一造成的差別 解決加樣過程中的差別內(nèi)參照基因多通道技術(shù)多通道技術(shù)：使用多種熒光染料在不同的檢測通道內(nèi)同時測定多種不同熒光染料發(fā)出的熒光1、引物及探針問題-引物及探針的相互干擾2、不同PCR反應要在同樣擴增條件下進行2、模板量差別-共用資源的相互競爭多

21、重PCR技術(shù)問題一個PCR管內(nèi)進行多重PCR擴增要解決的問題：FRRQFRRQFRRQRQ多重PCR技術(shù)問題1、引物及探針相互干擾問題FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2、共用資源的相互競爭多重PCR技術(shù)問題單雙通道同時進行，相互驗證FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ單單雙多重PCR技術(shù)問題提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 熔解曲線分析 基因分型（SNP）檢測實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：Temperature incre

22、asesFluorescencedecreasesTm Graph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescence recorded - Due to increasing temperature - Due to denaturation and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curveSYBR Green I 融解曲線分析熒光強度值隨溫度變化速率對溫度作圖(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green I 融解曲線分析S

23、YBR Green I 融解曲線分析10,000 copies非特異性產(chǎn)物目的產(chǎn)物目的產(chǎn)物10 copies10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線擴增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 se

24、c.SYBR Green I 融解曲線分析10,000 copies10 copies0 copies 溶解曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.擴增曲線SYBR Green I 融解曲線分析 進行可靠的定量實驗需要

25、對引物對進行優(yōu)化設計 用于優(yōu)化擴增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù) 引物設計 擴增片段選擇 試劑的濃度 循環(huán)條件 變性溫度和退火溫度Real-time PCR體系優(yōu)化利用動態(tài)溫度梯度功能一次實現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化Real-time PCR體系優(yōu)化45oC55oC65oC溶解曲線擴增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.Real-time PCR體系優(yōu)化提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術(shù)原理 熒光化學物質(zhì)簡介 多重PCR與內(nèi)參照基因定量PCR技術(shù)延伸 熔解曲線分析 基因分型（SNP）檢測實時熒光定量PCR技術(shù)簡介：FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAlle