肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定 - 河北科技大學(xué)大學(xué)英語精品課(共6頁)

1、實(shí)驗(yàn)教學(xué)教案(jio n)首頁本次實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定本次實(shí)驗(yàn)課時(shí)：驗(yàn)證性4學(xué)時(shí)教學(xué)要求： 1掌握實(shí)驗(yàn)原理，了解轉(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)及臨床意義 2. 掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定方法重 點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)原理、轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨基作用。 教學(xué)手段及教具：課堂講授，學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作。講授內(nèi)容及時(shí)間分配：課堂講授1相關(guān)知識(shí) 0.1 學(xué)時(shí)2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?0.1 學(xué)時(shí)3實(shí)驗(yàn)原理 0.3 學(xué)時(shí)4實(shí)驗(yàn)操作 0.2 學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)的操作技術(shù) 3 學(xué)時(shí)參考資料生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)肝臟(gnzng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定（驗(yàn)證性）相關(guān)(xinggun)知識(shí)酶的提純(tchn)基本操作程序及基本原則酶的活力單位（IU）的定義

2、及酶活力的測(cè)定（酶的定量測(cè)定）測(cè)定酶活力一般經(jīng)如下幾個(gè)步驟選擇適宜的一定濃度的底物。確定酶促反應(yīng)的條件。優(yōu)化條件將一定量的酶液和底物溶液混合，確定反應(yīng)時(shí)間（因要測(cè)定酶促反應(yīng)初速度） 。反應(yīng)到一定時(shí)間后取出反應(yīng)液終止反應(yīng)。測(cè)定產(chǎn)物的生成量。計(jì)算酶活力、酶的比活力。酶的比活力表示酶純度的指標(biāo)每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對(duì)固體(gt)酶：比活力(hul)活力(hul)單位/mg酶蛋白 對(duì)液體酶：比活力活力單位/ml酶液比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多?？偦盍Α⒓兓稊?shù)和回收率酶活力測(cè)定方法不同酶選用不同的方法氨基酸轉(zhuǎn)氨基作用、聯(lián)合脫氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨酶及臨床意義: 查肝功為什么要抽

3、血化驗(yàn)轉(zhuǎn)氨酶指數(shù)呢？谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，GOT）是人體內(nèi)糖和蛋白質(zhì)互相轉(zhuǎn)變所需的酶，人再生體內(nèi)分布廣泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝細(xì)胞漿中，AST存在于肝細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)。其次是腎、心、骨骼肌、脾等。AST的分布則以心肌最高，其次為肝、骨骼肌、腎臟等。谷丙轉(zhuǎn)氨酶為細(xì)胞內(nèi)酶，血清中活性很低，各組織器官中以心和肝的活性最高。當(dāng)某種原因使細(xì)胞膜通過性，轉(zhuǎn)氨酶可大量釋放入血液，血清中轉(zhuǎn)氨酶活性。抽血化驗(yàn)若轉(zhuǎn)氨酶比正常水平偏高則有可能肝組織受損破裂，肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液。（結(jié)合乙肝抗原等指標(biāo)進(jìn)一步確定是什么原因引起的）常作為疾病診斷、觀察療效和預(yù)后的指標(biāo)： 急性肝炎：S

4、-GPT、S-GOT 心肌梗塞：S-GOT一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私廪D(zhuǎn)氨酶的性質(zhì)及臨床意義掌握谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定方法二、實(shí)驗(yàn)(shyn)原理聯(lián)合脫氨基作用(zuyng)是大多數(shù)氨基酸的主要代謝方式，通過轉(zhuǎn)氨基作用與谷氨酸氧化脫氨基作用偶聯(lián)而完成。丙氨酸及酮戊二酸為谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用底物，利用內(nèi)源性（肝細(xì)胞已有的）磷酸吡哆醛作輔酶，在一定條件(tiojin)下及時(shí)間作用后測(cè)定所生成的丙酮酸的量來確定酶活力。丙酮酸能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成丙酸2,4二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈現(xiàn)棕色，其吸收光譜的峰為439530nm，可用于測(cè)定丙酮酸的含量。酮戊二酸也能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成相應(yīng)的苯腙，但后者在

5、堿性溶液中吸收光譜為與丙酸2,4二硝基苯腙的吸光度有差別，在520nm波長(zhǎng)比色時(shí)，丙酮酸2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520nm處吸光度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與酮戊二酸的摩爾比基本上呈線性關(guān)系，故可以測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（簡(jiǎn)稱 HYPERLINK /view/10817.htm t _blank GPT、 HYPERLINK /view/65582.htm t _blank ALT,在血清中的正常值是5(0)40U/L以內(nèi)）催化反應(yīng)：丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 谷氨酸丙氨酸GTP丙酮酸CH3CH3三、實(shí)驗(yàn)器材、試劑、材料(一)材料新鮮豬肝臟（二）器材722型分光光度計(jì)、

6、剪刀、吸管、玻璃均漿器（三）試劑標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液（ml相當(dāng)于500ug）；準(zhǔn)確稱取純化丙酮酸鈉62.5mg，溶于100ml 0.5mol/LH2SO4中，臨用前配制。谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物；稱取L-丙氨酸0.90g及-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液中，然后用mol/LNaOH調(diào)至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋至100ml，貯藏于冰箱內(nèi)，可保存一周。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）；稱取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于1000ml蒸餾水中。0.02%2,4二硝基苯肼；稱取2,4二硝基苯肼20mg溶于少量(sho

7、ling)mol/L HCl中，加熱溶解后，用mol/L HCl稀釋到100ml。0.4mol/LNaOH溶液(rngy) 生理鹽水四、實(shí)驗(yàn)(shyn)操作步聚準(zhǔn)備工作：打開水浴鍋恒溫37度；722E型分光光度計(jì)通電預(yù)熱。1.肝勻漿制備（每四組做1份，共用）將雞肝臟用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟0.25g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)（或小研砵中），加入2.25ml預(yù)冷的pH7.40.1%mol/L磷酸緩沖液，制成10%肝勻漿。吸取肝勻漿0.1ml于另一試管中，加入預(yù)冷的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）4.9ml搖勻，為稀釋肝勻漿（稀釋50倍）。2. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定（每組做1份）

8、取試管4支按下表加液測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)照管空白管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml0.50.5-混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫5分鐘稀釋肝勻漿/ml0.1-0.1-標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸-0.1-水-0.1混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫30分鐘2,4二硝基苯肼/ml0.50.50.50.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物/ml-0.50.5混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫30分鐘0.4mol/LNaOH5.05.05.05.0靜止10分鐘A520谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位：規(guī)定酶在37與底物作用30min后，能產(chǎn)生2.5ug的丙酮酸為一個(gè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力計(jì)算基礎(chǔ)：規(guī)定酶在37與底物作用30min后，能產(chǎn)生2.5ug的丙酮酸者為一個(gè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位。2. 測(cè)定管對(duì)照管的吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)管相比算出其相當(dāng)于丙酮酸含量。3. 根據(jù)公式計(jì)算：（注意稀釋倍數(shù)，理解公式）每毫升稀釋肝勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位：每克肝臟(gnzng)谷丙氨酶的活力單位。4計(jì)算(j sun)出比活力比活力(hul)活力單位/ml酶液六、注意事項(xiàng)分析（列表）各管與計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（OD值）相關(guān)的物質(zhì)成分。管別各管與實(shí)驗(yàn)結(jié)果有關(guān)的呈色反應(yīng)的物質(zhì)來源 空白管2,4二硝基苯肼？標(biāo)準(zhǔn)管2,4二硝基苯肼？2,4二硝基苯肼？對(duì)照管2,4二硝基苯肼？2,4二硝基苯肼？2,4二硝基苯肼？測(cè)定管2,4二硝基苯肼？2,4二硝基苯肼？2,4二硝基苯肼？2,