國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目：胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭

1、二、立論依據(jù) （包括項(xiàng)目的研究意義、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處）對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，論述項(xiàng)目的科學(xué)意義；對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用情景。重癥肝炎（又稱暴發(fā)性肝功能衰竭）發(fā)生多與肝炎病毒感染、化學(xué)藥物中毒等因素有關(guān)，我國(guó)又是病毒性肝炎發(fā)生大國(guó)，每年都有相當(dāng)一部分病人患重癥肝炎，每年僅重醫(yī)大附二院傳染科收治的重癥肝炎病人就近幾十例。重癥肝炎以起病急、病情進(jìn)展快、病死率高為特點(diǎn)，目前對(duì)它的發(fā)生機(jī)制仍未搞清，因此它嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。國(guó)內(nèi)現(xiàn)主要以綜合療法治療重癥肝炎，此療法雖對(duì)改善疾病的某些癥狀有一定幫助

2、，但并未從根本上改變?cè)摬〉念A(yù)后。國(guó)外多以肝移植來(lái)治療本病，其近期療效明確而肯定，但遠(yuǎn)期療效因受免疫排斥反應(yīng)的制約而不容樂觀。近兩年國(guó)內(nèi)幾家大醫(yī)院也相繼開展了肝移植手術(shù)，但受手術(shù)復(fù)雜性、器官來(lái)源以及接受肝移植者需長(zhǎng)期服用免疫抑制劑來(lái)避免排斥反應(yīng)發(fā)生所造成的高昂藥費(fèi)和長(zhǎng)期使用免疫抑制劑可能造成腎損害等因素的制約，仍限制了此療法的開展。人和哺乳動(dòng)物的肝臟具有強(qiáng)大的再生功能，2/3肝切除后的動(dòng)物在10-15天左右殘存肝臟可恢復(fù)到術(shù)前體積，而重癥肝炎患者多表現(xiàn)為缺乏這種再生能力。究其原因除了殘存肝細(xì)胞不能為機(jī)體代謝提供足夠的肝功能支持外，激活的免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥因子仍不斷造成殘存肝細(xì)胞壞死，甚至殺傷

3、新生肝細(xì)胞，從而嚴(yán)重阻礙了肝臟的再生。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)肝內(nèi)和浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥因子在造成肝細(xì)胞大量壞死、殺傷新生肝細(xì)胞方面起了極其重要的作用（1，2）。如果抑制或刪除肝內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞，或中和炎癥因子就能大大改善肝臟的再生能力（3，4，5）。在這些研究中人們多使用相應(yīng)的單克隆抗體來(lái)刪除或中和單核巨噬細(xì)胞和它們產(chǎn)生的炎癥因子。但單克隆抗體多來(lái)自小鼠雜交瘤細(xì)胞，用于人體治療受到限制。急性肝功能衰竭時(shí)如能提供一定數(shù)量的外源性肝細(xì)胞和某種能抑制肝內(nèi)單核巨噬細(xì)胞功能的物質(zhì)，起到既阻止殘存肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死和殺傷新生肝細(xì)胞，又能避免外源性肝細(xì)胞遭到排斥，同時(shí)還能支撐機(jī)體代謝需要，減輕殘

4、存肝細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，使它們有足夠時(shí)間再生，達(dá)到治愈肝功能衰竭的目的。眾多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明肝細(xì)胞移植加免疫抑制劑可滿足這一目的（6，7，8），但免疫抑制劑都是非特異地抑制機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)，在降低免疫反應(yīng)的同時(shí)也降低了機(jī)體的抵抗力，常常引起嚴(yán)重的繼發(fā)感染，而且免疫抑制劑多有嚴(yán)重的毒副作用，如臨床常用的環(huán)孢霉素A就有嚴(yán)重的腎毒性，這些在重癥肝炎常是導(dǎo)致病人死亡的危險(xiǎn)因素。1994年Hagiya從乳鼠肝臟中分離出一種能促進(jìn)肝臟再生的物質(zhì)，并克隆了它的cDNA，為它取名為肝再生增強(qiáng)因子（augmenter of liver regeneration，ALR）（9）。我們已從人胎肝組織中克隆出人ALR cD

5、NA，成功構(gòu)建了它的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了高效表達(dá)（10，11）。新近的研究發(fā)現(xiàn)ALR能通過抑制肝內(nèi)NK細(xì)胞的活性來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞再生（12，13）。在胎胰島細(xì)胞移植加ALR治療糖尿病大鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，凡在移植細(xì)胞部位加注ALR的大鼠血糖都恢復(fù)到正常水平，而單獨(dú)接受胎胰細(xì)胞移植治療的大鼠無(wú)一只血糖恢復(fù)正常，說明ALR使移植的胎胰細(xì)胞避免了排斥反應(yīng)，能存活并發(fā)揮功能（14）?；谶@些最新研究成果，我們擬探討胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合運(yùn)用治療急性肝功能衰竭的可行性及其相關(guān)機(jī)制，期望為臨床治療重癥肝炎找到確實(shí)有效，又經(jīng)濟(jì)可行的治療方法；同時(shí)探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評(píng)價(jià)凍存細(xì)胞作為供者細(xì)

6、胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法；并通過本研究觀察在急性肝損傷時(shí)血和肝組織中ALR和TNF-、IL-1等炎癥因子的變化關(guān)系，進(jìn)一步闡明ALR的作用機(jī)理。本課題如獲成功必將為重癥肝炎患者帶來(lái)福音，產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。顧長(zhǎng)海，王宇明。急性肝衰竭。成都；四川科學(xué)技術(shù)出版社，1997；11-21 2Nikola LV, Lorenzo P, Alessandro A, et al. Changes of liver-resident NK cells during liver regeneration in rats. J Immunology 1995; 154:6

7、324-63383Blazka ME, Elwell MR, Holladay SD, et al. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: ole of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996; 24:181-189 4Tamura F, Masuhara A, Sakaida I, et al. FK506 promates liver regeneration by suppressing natural kill

8、er cell activity. J Gastroenterol Hepatol 1998; 13:703-708Boulton RA, Alison MR, Golding M, et al. Augmentation of the early phase of liver regeneration after 70% partial hepatectomy in rats following selective kuffer cell depletion. J Hepatol 1998; 29:271-280Takeshita K, Ishibashi H, Suzuki M, et a

9、l. Hepatocellular transplantation for metabolic support in experimental acute ischemic liver failure in rats. Cell Transplant 1993; 2:319-324Demetriou AA, Reisner A, Sanchez J, et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatectomized rats. Hepatology 1988; 8:1006

10、-1009Mito M, Susano M, Sawa M, et al. Hepatocyte transplantation for hepatic failure. Transplant Rev 1993; 7:35-43Michio Hagiya, Antonio Francavilla, Lorenzo Polimeno, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: Expression of biologically active recombi

11、nant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91:8142-8146中華肝臟病雜志。1999; 7(3)中華肝臟病雜志 2000；8（1）Francavilla A, Vujanovic NL, Polimeno L, et al. The in vivo effect of hepatotrophic factors augmenter of liver regeneration, hepatocyte growth factor, and insulin-like g

12、rowth factor-II on liver natural killer cell functions. Hepatology 1997; 25:411-415Tanigawa K, Sakaida I, Masuhara M, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) may promote liver regeneration by reducing natural killer (NK) cell activity in human liver diseases. J Gastroenterol 2000; 35:112-119Ada

13、ms GA, Maestri M, Squiers EC, et al. Augmenter of liver regeneration enhances the success rats of fetal pancreas transplantation in rodents. Transplantation 1998; 65:32-36 3 三、研究方案研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)：通過本研究探討胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合運(yùn)用治療急性肝功能衰竭的可行性及其相關(guān)機(jī)制，期望為臨床治療重癥肝炎找到確實(shí)有效，又經(jīng)濟(jì)可行的治療方法。同時(shí)探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評(píng)價(jià)凍存細(xì)胞作為

14、供者細(xì)胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法。同時(shí)通過觀察在急性肝損傷時(shí)血和肝組織中ALR和TNF-、IL-1等炎癥因子的變化關(guān)系來(lái)進(jìn)一步闡明ALR的作用機(jī)理。研究?jī)?nèi)容：a：D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型；b：型膠原酶灌注消化胎鼠肝臟制備胎肝細(xì)胞；c：電轉(zhuǎn)化帶有HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-S入胎肝細(xì)胞；d：ELISA法或免疫組化法檢測(cè)含pCDNA3.1-S的胎肝細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)表達(dá)HBsAg的情況；e：比較經(jīng)不同凍存條件、不同凍存時(shí)間處理后，胎肝細(xì)胞復(fù)蘇存活率；f：用ELISA法和免疫組化法檢測(cè)造模組和正常鼠血及肝組織中的ALR，了解ALR的變化

15、情況；g：用組氨酸親和層析柱純化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)的大鼠ALR；h：比較不同治療組與對(duì)照組間、不同治療組間動(dòng)物存活率的差別；i：比較不同治療組與對(duì)照組間、不同治療組間肝臟生化指標(biāo)、常規(guī)病理變化；j：免疫組化法檢測(cè)不同治療組存活動(dòng)物肝組織內(nèi)HbsAg的表達(dá)及分布，以判斷移植細(xì)胞的存活情況；k：用ELISA法和Northern blot檢測(cè)不同處理組動(dòng)物血中和肝組織內(nèi)TNF-、IL-1水平及它們的mRNA表達(dá)情況，探討ALR的作用機(jī)理；l：比較不同治療組與對(duì)照組間、不同治療組間腎臟生化指標(biāo)、常規(guī)病理變化。 擬解決的關(guān)鍵問題：重癥肝炎的高死亡率一直困擾著臨床醫(yī)生，除肝移植外至今仍無(wú)有效治

16、療方法。我們擬通過本研究探明胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭的可行性，希望能為重癥肝炎的治療找到突破性方法。探索胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，評(píng)價(jià)凍存細(xì)胞作為供者細(xì)胞的可行性，為今后臨床應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法。同時(shí)可進(jìn)一步闡明ALR的作用機(jī)理、在急性肝損傷時(shí)的變化規(guī)律以及明確它在肝臟的細(xì)胞來(lái)源。4擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析（1）研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案： D-氨基半乳糖制備 膠原酶消化胎鼠肝 凍存、復(fù)蘇 大鼠急性肝衰竭模型 制備胎肝細(xì)胞 純化的大鼠ALR 電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pCDNA3.1-S 至胎肝細(xì)胞 對(duì)照組 FLCCsA FLCALR FLC ALR 比

17、較各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo) 如果FLCALR組有效， 再與凍存細(xì)胞進(jìn)行治療比較 注：圖中FLC為胎肝細(xì)胞；CsA為環(huán)孢霉素A；ALR為肝再生增強(qiáng)因子。 （2）可行性分析：本課題的難點(diǎn)是消化分離胎肝細(xì)胞、胎肝細(xì)胞的凍存復(fù)蘇、獲取大量純品ALR和鑒定移植的胎肝細(xì)胞存活狀況。對(duì)于前兩項(xiàng)相信通過反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件一定能獲得滿意結(jié)果。由于本課題是我們前一自然科學(xué)基金項(xiàng)目的延續(xù)。我們已構(gòu)建了人和大鼠ALR的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功地將其在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高效表達(dá)菌株，只要將表達(dá)產(chǎn)物用帶鎳離子的層析柱分離就可得到大量純品ALR。我們研究所已構(gòu)建了一系列含HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，只要將這

18、些表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胎肝細(xì)胞再用于移植，就能區(qū)判定移植細(xì)胞的存活情況。此外我們還完成了人和大鼠ALR的多克隆和單克隆抗體的制備，為檢測(cè)血和肝組織中的ALR提供了檢測(cè)手段，要完成本課題研究應(yīng)不成問題。本項(xiàng)目的創(chuàng)新之處首次探討胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝功能衰竭的可行性；首次觀察急性肝損傷時(shí)血和肝組織內(nèi)ALR的表達(dá)變化情況及它對(duì)TNF-、IL-1等炎癥產(chǎn)生的影響；首次探討胎肝細(xì)胞低溫保存和復(fù)蘇條件，以及作為移植供者細(xì)胞的可行性。54. 年度研究計(jì)劃及預(yù)測(cè)進(jìn)展2002年112月：完成動(dòng)物肝損傷模型建立的預(yù)實(shí)驗(yàn)、ALR表達(dá)的肝內(nèi)定位； 完成胎肝細(xì)胞的制備、胎肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、HbsAg表達(dá)的鑒定； 完成大鼠A

19、LR的表達(dá)及純化； 完成不同保存條件、不同保存時(shí)間胎肝細(xì)胞復(fù)蘇存活率比較；2003年112月：完成胎肝細(xì)胞移植與ALR聯(lián)合治療大鼠急性肝衰的療效評(píng)價(jià)； 完成新分離與凍存胎肝細(xì)胞與ALR聯(lián)合治療大鼠急性肝衰的療效評(píng)價(jià)； 完成不同處理組動(dòng)物血及肝組織內(nèi)TNF-、IL-1變化的比較； 2004年1 6月：完成所有的研究工作。 612月：總結(jié)資料，發(fā)表文章及申報(bào)成果。預(yù)期研究成果 通過本研究探明胎肝細(xì)胞移植加ALR治療急性肝衰竭的可行性，如能成功將為臨床治療重癥肝炎找到了突破性方法，這必將產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)探索出胎肝細(xì)胞的最佳凍存、復(fù)蘇條件，為今后臨床應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)供者細(xì)胞短缺提供解決辦法

20、。通過本研究還進(jìn)一步闡明ALR的作用機(jī)理、在急性肝損傷時(shí)的變化規(guī)律，為重組人ALR今后的臨床應(yīng)用前景作出科學(xué)評(píng)估并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究成果將以論文形式發(fā)表在中華系列或國(guó)際刊物上（預(yù)計(jì)完成論文4-7篇），并申報(bào)相應(yīng)的科技成果獎(jiǎng)。6 四、研究基礎(chǔ)1. 與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)本課題為我們前一“自然科學(xué)基金項(xiàng)目“的延續(xù)。在前一課題中我們已完成人ALR讀碼框的cDNA克隆及測(cè)序，與國(guó)外報(bào)道的大量鼠ALR讀碼框的核苷酸及氨基酸序列比較，其同源性分別為86.5%和85.6%，構(gòu)建了人ALR的真、原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功地將其在真核和原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，獲得了高效表達(dá)菌株和重組的

21、人ALR。此后又完成了大鼠ALR讀碼框的cDNA克隆和真、原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)。去年我們又進(jìn)一步完成了由重慶市衛(wèi)生局資助的針對(duì)人和大鼠ALR的多克隆和單克隆抗體的制備。此外，我們研究所已構(gòu)建了一系列含HBV-S基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。這些成果的取得為本課題的研究提供了可靠的物質(zhì)保障。課題申請(qǐng)者長(zhǎng)期從事病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)理及治療的研究。作為課題的主研人員之一曾參加過研究所承擔(dān)的國(guó)家“六.五”、“七.五”、“八.五”有關(guān)病毒性肝炎防治的攻關(guān)課題研究，多次榮獲國(guó)家科委、衛(wèi)生部、四川省和重慶市的科技進(jìn)步獎(jiǎng)。9093年底作為訪問學(xué)者赴英國(guó)伯明翰大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝病中心從事免疫抑制藥物FK506作用

22、機(jī)理的課題研究，回國(guó)后又承擔(dān)了國(guó)家教委優(yōu)秀青年教師基金和國(guó)家自然科學(xué)基金資助的“肝細(xì)胞生長(zhǎng)多肽基因克隆及其對(duì)免疫系統(tǒng)影響”的課題研究。申請(qǐng)者具有扎實(shí)的分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論知識(shí)，極強(qiáng)的科研能力和實(shí)驗(yàn)技能，課題組主要成員均有長(zhǎng)期從事實(shí)驗(yàn)研究的工作經(jīng)歷，這為本課題能順利進(jìn)行提供了可行的人員和技術(shù)力量的保證。2. 已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑（包括利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況） 我所為國(guó)家教委重點(diǎn)學(xué)科，我所為衛(wèi)生部臨床藥理實(shí)驗(yàn)基地和重慶市分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，擁有良好的工作條件和許多精密儀器。其主要設(shè)備有：超速離心機(jī)、液相閃爍計(jì)數(shù)儀、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式高速

23、冷凍離心機(jī)2臺(tái)、全波長(zhǎng)分光光度儀、-射線能譜儀、CO2培養(yǎng)箱3臺(tái)、PCR儀2臺(tái)、超凈工作臺(tái)、多功能電泳儀、核酸測(cè)序儀、低溫冰凍離心機(jī)、超低溫冰箱、電轉(zhuǎn)化儀、凝膠成像系統(tǒng)、高壓和常壓層析系統(tǒng)、超聲破碎儀、蛋白質(zhì)電泳裝置、熒光顯微鏡、細(xì)胞收集器、倒置顯微鏡、多功能掃描儀等。73. 申請(qǐng)者和項(xiàng)目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡(jiǎn)歷，近期已發(fā)表與本項(xiàng)目有關(guān)的主要論著目錄*和獲得學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況及在本項(xiàng)目中承擔(dān)的任務(wù)；青年科學(xué)基金申請(qǐng)者還應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位8篇* 論文：作者題目刊名年份卷（期）頁(yè)碼 專著：作者書名出版者年份8 五、經(jīng)費(fèi)預(yù)算支 出 科 目金 額（萬(wàn)元）計(jì) 算 根 據(jù) 及 理 由1

24、. 合 計(jì)200（一）科研業(yè)務(wù)費(fèi)25實(shí)驗(yàn)動(dòng)物0.8大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及飼料等文獻(xiàn)檢索,資料復(fù)印0.3論文發(fā)表,會(huì)議,成果鑒定0.8臨工費(fèi)0.6300元/月20月 (二)實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)158生化試劑40D-氨基半乳糖、IV膠原酶、組氨酸親和柱等免疫學(xué)試劑25IL-1、TNF-檢測(cè)Kit，ELISA和免疫組化檢測(cè)試劑分子生物學(xué)試劑45DIG-標(biāo)記、總RNA提取Kit，引物合成, Taq酶, dNTP,細(xì)胞培養(yǎng)25DEME、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、液氮、CO2等其他常用試劑15細(xì)菌培養(yǎng)基、Hank氏液、常用試劑等低值易耗物品08細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)檢測(cè)板、細(xì)菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等（

25、三）協(xié)作費(fèi)07病理切片制作、病理診斷等（四）項(xiàng)目組織實(shí)施費(fèi)10占總經(jīng)費(fèi)的5% 注: 預(yù)算支出科目按下列順序填寫: 1. 科研業(yè)務(wù)費(fèi) 2. 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi) 3. 儀器設(shè)備費(fèi) 4. 實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi) 5. 協(xié)作費(fèi) 6. 項(xiàng)目組織實(shí)施費(fèi)。開支范圍詳見國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目財(cái)務(wù)管理辦法第二章。9 六、申請(qǐng)者正在承擔(dān)的其它研究項(xiàng)目 （攀登計(jì)劃、863計(jì)劃、攻關(guān)任務(wù)和各部委、省市任務(wù)等項(xiàng)目的名稱及編號(hào)、任務(wù)來(lái)源、起止年月、負(fù)責(zé)或參加以及與本申請(qǐng)項(xiàng)目的關(guān)系等情況） 作為課題負(fù)責(zé)人正在執(zhí)行教育部骨干教師基金教技司（2000）65文資助的研究。起止日期：2000.12002.12。此研究屬ALR系列研究之一。七、申請(qǐng)

26、者承擔(dān)（負(fù)責(zé)或參加）國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目的情況批準(zhǔn)號(hào)項(xiàng)目名稱起止年月負(fù)責(zé)或參加進(jìn)展或完成情況1996年1月1998年12月負(fù)責(zé)已完成10 對(duì)申請(qǐng)者負(fù)責(zé)的前一個(gè)已結(jié)題科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱及批準(zhǔn)號(hào)）完成情況，后繼研究進(jìn)展及與本申請(qǐng)項(xiàng)目的關(guān)系加以詳細(xì)說明。另附該已結(jié)題項(xiàng)目研究工作總結(jié)摘要（300字）及已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁(yè)復(fù)印件（限三篇）。申請(qǐng)者負(fù)責(zé)的由自然科學(xué)基金資助的已于98年12月結(jié)題。現(xiàn)已構(gòu)建大鼠ALR的原核表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究ALR的生物學(xué)功能和作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。ALR是近年才發(fā)現(xiàn)并克隆的一種新的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，人ALR是最近兩年由國(guó)內(nèi)學(xué)者率先克隆成功的，所以對(duì)它的生物學(xué)功能

27、才剛剛起步。從在體內(nèi)的廣泛分布來(lái)看，它的生物學(xué)功能應(yīng)遠(yuǎn)不止限于促肝細(xì)胞生長(zhǎng)，其作用部位也不應(yīng)限于肝臟。目前即使是它在肝臟損傷后再生時(shí)的作用機(jī)理的研究也少有報(bào)道。我們希望通過本課題研究進(jìn)一步闡明它的作用機(jī)理以及與臨床肝損傷后肝再生的關(guān)系，為它今后的臨床應(yīng)用提供切實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)題項(xiàng)目研究工作總結(jié)摘要：以人胎肝總RNA為模板，用RT-PCR和基因重組技術(shù)克隆了人ALR閱讀框cDNA，它全長(zhǎng)378個(gè)核苷酸，編碼125個(gè)氨基酸。與大鼠ALR和人ALR閱讀框的核苷酸序列同源性分別為86.5和99.2。將克隆片段分別裝入pET-11a和pcDNA3質(zhì)粒中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-11a-hALR和真

28、核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hALR，并在大腸桿菌BL21（DE3）和COS-7細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。在BL21（DE3）中的表達(dá)量占菌體蛋白量的20%，分子量約為15KD，用轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞勻漿測(cè)活，僅細(xì)胞勻漿有刺激活性。在體外它能刺激HepG2、QGY等肝源性細(xì)胞增殖，不能使L929細(xì)胞增殖。首次觀察了重組人ALR在體外對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞在PHA刺激下產(chǎn)生IL-2和T13細(xì)胞（NK細(xì)胞系瘤株）在LPS刺激下產(chǎn)生IL-1、TNF-的影響，發(fā)現(xiàn)它對(duì)以上兩種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子均無(wú)影響。 八、申請(qǐng)者承諾 我保證上述填報(bào)內(nèi)容的真實(shí)性。如果獲得資助，我與本項(xiàng)目組成員將嚴(yán)格遵守國(guó)家自然科學(xué)基金

29、委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，按計(jì)劃認(rèn)真開展研究工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。 申請(qǐng)者（簽章） 年 月 日11 九、推薦意見 （不具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請(qǐng)者，須有兩名具有高級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推薦。推薦時(shí)，請(qǐng)認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請(qǐng)者及其項(xiàng)目組成員的業(yè)務(wù)基礎(chǔ)、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。項(xiàng)目組成員不能做推薦者） 推薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長(zhǎng) 所在單位： 推薦者（簽章） 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長(zhǎng) 所在單位：12十、申請(qǐng)者所在單位及合作單位的審查與保證申請(qǐng)者所在單位學(xué)術(shù)委員會(huì)的審查意見（包括：對(duì)項(xiàng)目的意義、特色和創(chuàng)新之處及申請(qǐng)者的研究水平與學(xué)風(fēng)簽署具體意見）重癥肝炎的高死亡率一直困擾著臨床醫(yī)生，除肝移植外至今仍無(wú)有