成體干細(xì)胞概述和體外培養(yǎng)及特性

1、成體干細(xì)胞概述和體外培養(yǎng)及特性 概述成體干細(xì)胞分化的可塑性 成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和特性 成體干細(xì)胞研究中的問(wèn)題 成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 概述一、定義成體干細(xì)胞是指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞,又稱組織特異性干細(xì)胞(Tissue-specific stem cell)。 傳統(tǒng)觀點(diǎn) 干細(xì)胞一旦分化成熟，就不再分裂增殖了；成體干細(xì)胞的發(fā)育潛能是限能或少能的；成體干細(xì)胞只能分化為特定組織器官若干類型細(xì)胞。 轉(zhuǎn)折點(diǎn)1997年初，英國(guó)科學(xué)家Wilmut等用體外培養(yǎng)、高度分化的母羊乳腺細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞，克隆出了 “Dolly”。

2、 表明某些高度分化的體細(xì)胞核仍具有一套完整的遺傳信息，能指導(dǎo)胚胎發(fā)育成為一個(gè)完整的新個(gè)體。 在特定的條件下，分化的體細(xì)胞仍具發(fā)育的全能性。 與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞具有許多優(yōu)勢(shì)：成體干細(xì)胞不存在組織相容性的問(wèn)題，治療時(shí)可避免長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑對(duì)患者的傷害。胚胎干細(xì)胞能分化成各種細(xì)胞類型，但這種分化是“非定位性”的。目前，尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定的部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞，容易導(dǎo)致畸胎瘤。成體干細(xì)胞也具有類胚胎干細(xì)胞的高度分化能力。二分 化目前，比較一致的看法是： 成體干細(xì)胞是一種尚未終末分化的、處于干細(xì)胞/祖細(xì)胞或前體細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞；正常生理?xiàng)l件下，傾向分化為所在特定組織的若干種細(xì)胞；

3、外界條件誘導(dǎo)下，成體干細(xì)胞能超越該特定組織，分化成其他的功能細(xì)胞，補(bǔ)充參與損傷組織的修復(fù)等。 三特征多能性 廣泛性 遷移性 可調(diào)控性 增生活躍組織（如黏膜、骨髓）不活躍組組織（如神經(jīng)脂肪、肺部）。 體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的中介環(huán)節(jié)。Blau等將干細(xì)胞借助于循環(huán)穿梭于組織的特性成為“干細(xì)胞高速公路”。 高度依賴于干細(xì)胞所處的三維空間結(jié)構(gòu)和多維的分化信號(hào)。微環(huán)境中的細(xì)胞因子、同種或異種細(xì)胞之間的接觸、細(xì)胞外基質(zhì)成分等對(duì)成體細(xì)胞的分化方向與進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用。 成體干細(xì)胞分化的可塑性 目前對(duì)于可塑性的機(jī)制有幾種假說(shuō): 假說(shuō)1 成熟的組織內(nèi)的確存在由胚胎時(shí)殘留下來(lái)的多能干細(xì)胞。 Verfaillie等證實(shí)

4、在成體許多組織中余存著一種稀有數(shù)量的胚胎樣原始干細(xì)胞，表達(dá)胚胎干細(xì)胞的遺傳標(biāo)志，體外的培養(yǎng)條件也基本類似于胚胎干細(xì)胞。 假說(shuō)2 可塑性是細(xì)胞融合的結(jié)果。 20世紀(jì)初期，通過(guò)細(xì)胞融合產(chǎn)生雜合體而改變細(xì)胞命運(yùn)，例如將肌母細(xì)胞與纖維母細(xì)胞融合后，可在纖維母細(xì)胞內(nèi)觀察到肌蛋白表達(dá)； 將鼠骨髓細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)后，骨髓細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生明顯的逆向分化，獲得胚胎干細(xì)胞特征； 最近有研究人員將熱休克的小氣道上皮細(xì)胞與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察到間質(zhì)干細(xì)胞與損傷的氣道細(xì)胞融合新生出氣道上皮，而且融合率大于1%，推測(cè)在體內(nèi)出現(xiàn)急性器官衰竭和組織壞死時(shí)有可能通過(guò)細(xì)胞融合完成組織修復(fù). 假說(shuō)3

5、細(xì)胞由成熟狀態(tài)去分化為較原始狀態(tài)，隨后再分化為成熟的其他類型細(xì)胞，“克隆羊多利”明確顯示細(xì)胞的遺傳信息可以被再程序化，體細(xì)胞可以去分化成為多能干細(xì)胞. 低等脊椎動(dòng)物的研究，顯示損傷部位可以出現(xiàn)與胚胎發(fā)育類似的未分化細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，嶸螺的研究表明其通過(guò)局部已分化終末細(xì)胞去分化完成修復(fù)功能. 分化就是受精卵發(fā)育成成體的過(guò)程中，細(xì)胞完成結(jié)構(gòu)功能定向改變的過(guò)程，實(shí)質(zhì)是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。 去分化就是脫分化，分化細(xì)胞失去其特有結(jié)構(gòu)而變成具有未分化細(xì)胞特征的過(guò)程。在動(dòng)物中, 去分化細(xì)胞具有胚胎間質(zhì)細(xì)胞的功能。在植物中, 去分化細(xì)胞成為薄壁細(xì)胞, 稱為愈傷組織(callus)。去分化往往隨之又發(fā)生再分化(r

6、edifferentiation)。 1、骨髓干細(xì)胞 2、神經(jīng)干細(xì)胞 4、骨骼肌干細(xì)胞 3、肝干細(xì)胞 1、骨髓干細(xì)胞 骨髓由不同類型多種細(xì)胞成分組成的組織，除了分化的血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等，還存在兩類成體干細(xì)胞： 一類是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell,HSC）,能生成各種血細(xì)胞； 另一類是間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），能生成內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。 體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞，HSC細(xì)胞呈懸浮集落生長(zhǎng)，而MSC細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)，通過(guò)換液很容易把兩者分開(kāi)。 間質(zhì)干細(xì)胞 證明可分化為包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，也能分化成內(nèi)

7、皮細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。 當(dāng)MSC細(xì)胞移植入小劑量射線照射的宿主，則造血系統(tǒng)和胃腸道組織有所增多，表明MSC細(xì)胞在異常環(huán)境中，細(xì)胞分化的可塑性增加。 造血干細(xì)胞 HSC移植至不同的體內(nèi)微環(huán)境，可分化為3個(gè)胚層的各種類型細(xì)胞，包括心肌、骨骼肌、血管內(nèi)皮系統(tǒng)、肝細(xì)胞、肺泡、食道、腸道、胃、膽管以及皮膚和神經(jīng)細(xì)胞等。 HSC細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞系之間，即淋巴細(xì)胞系與髓性細(xì)胞系之間和系內(nèi)也存在分化方向的轉(zhuǎn)變。 Hematopoiesis 造血Hematopoietic stem cellCommon lymphoid progenitor （淋巴系）Common myeloid progeni

8、tor （髓系）NK cellB cellT cellGran/Mac progenitorErythro/Plt progenitorRBCPlateletmacrophageneutrophilbasophileosinophil2、神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)系統(tǒng)中一類能自我更新，并產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。 主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩個(gè)神經(jīng)發(fā)生區(qū)域：腦的海馬區(qū)和次腦室區(qū)，以及包括脊髓等其他非神經(jīng)性的區(qū)域。 通過(guò)個(gè)體發(fā)育不同階段的神經(jīng)干細(xì)胞移植至宿主不同部位，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能具有發(fā)育階段的依賴性，說(shuō)明成體中的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能受到一定的限制。 1999年，Bjorns

9、on將從成年小鼠腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞移植入經(jīng)X射線照射過(guò)的小鼠骨髓部位，分化出血液細(xì)胞，開(kāi)創(chuàng)了成體干細(xì)胞跨越組織或胚層分化研究的先例。 3、肝干細(xì)胞 對(duì)肝干細(xì)胞存在與否的問(wèn)題一直有爭(zhēng)論。 對(duì)發(fā)育中的肝臟具有自我更新能力的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)和分析，證明其內(nèi)的卵圓形細(xì)胞在體外能大量增殖，細(xì)胞移植后可分化，表明肝卵圓形細(xì)胞是肝干細(xì)胞，具有分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙潛能性。 肝干細(xì)胞的鑒定 肝干細(xì)胞本身缺乏特異性標(biāo)志，分離和鑒定帶來(lái)了困難。 雙潛能的肝干細(xì)胞同時(shí)表達(dá)肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，細(xì)胞角蛋白CK7和CK19為膽上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志； 白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)和肝代謝酶細(xì)胞

10、色素P450可 作特異性標(biāo)志物； 細(xì)胞角蛋白CK8和CK18在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞都有表達(dá)。肝干細(xì)胞一般除了其特有的形態(tài)學(xué)外，常結(jié)合上述特有標(biāo)志，通過(guò)免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞檢測(cè)和原位雜交等方法予以鑒定。 肝干細(xì)胞的可塑性 雙潛能卵圓形細(xì)胞不僅能分化為肝細(xì)胞和膽上皮細(xì)胞，當(dāng)分別移植到胰腺和十二指腸時(shí)，還能跨組織分化為胰腺細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞，表明肝干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中能被誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的其他組織細(xì)胞，目前，還未見(jiàn)有跨胚層分化的直接例證。 卵圓形細(xì)胞異常分化或分化突然停止有可能發(fā)生肝細(xì)胞癌。 4、骨骼肌干細(xì)胞 肌肉的生長(zhǎng)、更新和修復(fù)是由衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells）介導(dǎo)的，一般認(rèn)為這

11、就是骨骼肌干細(xì)胞。 近年的研究表明，從肌肉分離的干細(xì)胞不僅能分化出肌肉，還能產(chǎn)生血液細(xì)胞成分。 骨骼肌干細(xì)胞不僅存在于骨骼肌組織，而且具有分化的可塑性，甚至跨越胚層分化為肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。 成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和特性 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 造血干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 1、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 （MSC） 近年的研究已表明間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）能向軟骨、骨、脂肪、造血基質(zhì)和神經(jīng)元樣等細(xì)胞分化，使其首選為組織工程中的種子細(xì)胞。 最初，用含血清的完全培養(yǎng)基或無(wú)血清化學(xué)限定性培養(yǎng)液使孵化日齡雞胚肢芽的骨髓MSC原代培養(yǎng)獲得成功。 隨后，大鼠、人和兔的骨髓MSC原代和繼代培養(yǎng)也有進(jìn)展。 大鼠骨髓MSC細(xì)胞體外培養(yǎng) 取大鼠

12、股骨，Tyrodes液洗滌干凈 用注射器吸10ml含血清的DMEMLG培養(yǎng)液，將針頭插入除去骨骺后的股骨一端的骨髓腔，注入培養(yǎng)液 從骨的另一端收集，反復(fù)抽吸，打散成細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)有核細(xì)胞密度至5107個(gè)/ml，接種到直徑為10mm的培養(yǎng)皿中 37,5%CO2 每隔34天換液一次，一般經(jīng)2周左右可形成一些較大的細(xì)胞克隆 體外生長(zhǎng)特性 原代培養(yǎng)物中多為成纖維樣細(xì)胞，紅細(xì)胞在此培養(yǎng)液中不能存活，而且不貼壁，通過(guò)換液而洗除。 MSC中混雜的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，造血細(xì)胞等，由于它們的貼壁黏附能力不同，通過(guò)調(diào)整胰蛋白酶EDTA的消化時(shí)間，保證在短暫消化時(shí)間內(nèi)，使MSC與培養(yǎng)皿底脫離，而其他細(xì)胞仍貼附于培養(yǎng)皿

13、底，從而使MSC在傳代期間進(jìn)一步得到純化。 MSC生長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭形，成索密集排列。 鑒定包括人在內(nèi)的MSC的直接標(biāo)志物SH2、SH3、CD44、CD71、CD94、CD124、CD14、CD34等。 還可通過(guò)檢測(cè)它們成骨和成軟骨能力予以鑒定。 2、造血干細(xì)胞 胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)造血功能的組織是卵黃囊。 胎兒出生前，胚胎肝臟是主要的造血組織，內(nèi)含較多的造血干細(xì)胞，人胚發(fā)育至6個(gè)月后，骨髓組織造血功能逐漸明顯，而肝臟的造血功能逐漸減少。 出生后，造血細(xì)胞主要存在于紅髓內(nèi)。 紅髓：脾臟白髓周圍的區(qū)域，包括脾索和脾竇，脾索含大量B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，由脾索圍成的脾竇內(nèi)充滿血液。脾索和脾竇壁

14、的巨噬細(xì)胞能吞噬和清除血液中衰老紅細(xì)胞和病原體。 脾臟內(nèi)部可分為紅髓及白髓。紅髓的主要功能是過(guò) 濾和儲(chǔ)存血液，由脾索及血竇組成，但因?yàn)槠洳缓斎肓馨凸?，所以脾臟不能過(guò)濾淋巴的功能。而白髓的主要功能則為對(duì)抗外來(lái)微生物及感染。 在正常狀態(tài)下一般摸不到脾臟，如果仰臥或右側(cè)臥位可能觸摸到脾臟邊緣即可認(rèn)為是脾大，近年來(lái)B超在臨床的廣泛應(yīng)用： 引起脾大的原因有： （1）感染性脾大。各種急、慢性感染如傷寒、副傷寒、黑熱病、血吸蟲病、瘧疾、病毒性肝炎、敗血癥、晚期梅毒等. （2）郁血性脾腫大。斑替氏綜合征、肝硬化、慢性心力衰竭致心原性肝硬化、慢性縮窄性心包炎、門靜脈或脾靜脈血栓形成。 （3）增生性脾大。見(jiàn)于某

15、些血液病如白血病、溶血性貧血、惡性淋巴瘤等。 （4）其它。脾臟惡性腫瘤較罕見(jiàn)、脾臟囊腫、播散性紅斑狼瘡、皮肌炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、高雪氏病等。 因脾臟大原因較復(fù)雜，除少數(shù)人為生理性外，都應(yīng)在醫(yī)生指導(dǎo)下尋找病因，并要定期復(fù)查。 3、神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和建系，必須滿足兩個(gè)基本條件： 具有永生化特性即在細(xì)胞周期內(nèi)不斷地復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量子代細(xì)胞； 具有神經(jīng)干細(xì)胞世系遺傳顯性特性 即神經(jīng)干細(xì)胞表型，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和條件下，它可分化為神經(jīng)元和包括星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及Schwanns細(xì)胞等在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 體外培養(yǎng)建系 早期胚胎的神經(jīng)管和神經(jīng)嵴或胎兒的腦組織是體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的最理想材料

16、來(lái)源。 首要問(wèn)題是維持其分裂、增殖的能力。 基本培養(yǎng)基是一種特定的N2液。添加因子有葡萄糖、人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、二氫氯丁二胺、硒酸鈉、谷氨酰胺和肝素等。 細(xì)胞傳代時(shí)，用手術(shù)刀片沿著神經(jīng)球中間的縱橫軸切割成四等份，則神經(jīng)干細(xì)胞可維持穩(wěn)定而快速的生長(zhǎng)。 生物學(xué)特性 未分化的神經(jīng)干細(xì)胞一般每隔710天細(xì)胞數(shù)可增加一倍，一般可傳35代，歷時(shí)一年，在這期間，細(xì)胞系可分化為神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等多能性。 成體干細(xì)胞研究中的問(wèn)題 限制成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要因素是來(lái)源困難 成體干細(xì)胞在體外傳代中端粒酶活性很快下降，可能是造成成體干細(xì)胞不能在體外大量擴(kuò)增的主要原因. 1、異質(zhì)性 2、干細(xì)胞

17、所處環(huán)境 3、可塑性的調(diào)控 4、分化細(xì)胞的功能 5、體外增殖 1、異質(zhì)性（heterogeneity） 指由于不同遺傳機(jī)制而產(chǎn)生相同或類似的表現(xiàn)型。異質(zhì)性在某種程度上是干細(xì)胞固有的特性。 成體干細(xì)胞的可塑性是否與干細(xì)胞異質(zhì)性直接相關(guān)？一種干細(xì)胞與其組織來(lái)源及歸宿之間的確切關(guān)系？等，還需要深入的研究。 2、干細(xì)胞所處環(huán)境 環(huán)境的信號(hào)對(duì)干細(xì)胞的分化命運(yùn)有著重要影響。 如，小鼠造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞都能分化出肝細(xì)胞，并能修復(fù)小鼠受損的肝組織，但，移植造血干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞對(duì)修復(fù)小鼠受損的肝組織的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)比移植成熟肝干細(xì)胞本身差得多。 干細(xì)胞在接受亞致死劑量照射等異常環(huán)境下被觀察到“可塑性”現(xiàn)象，人們

18、還難以解釋。 3、可塑性調(diào)控 外源性內(nèi)源性體液因子、同種或異種細(xì)胞的接觸、細(xì)胞外基質(zhì)等的作用大多數(shù)干細(xì)胞的可塑性研究是基于組織損傷而造成的微環(huán)境一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子在其中起著重要的作用。尚在起步階段成體干細(xì)胞“可塑性”調(diào)控的解釋(4種)： 機(jī)體中存在著多種來(lái)源和不同分化方向的成體干細(xì)胞群體，能定向地向各自的組織來(lái)源的細(xì)胞分化； 機(jī)體中存在著一種多潛能的成體干細(xì)胞，在不同的微環(huán)境信號(hào)刺激下，可向不同組織的細(xì)胞方向分化； 特定組織來(lái)源的成體干細(xì)胞，除了向該組織的細(xì)胞分化外，在特殊信號(hào)的刺激下，可重新編程，繼續(xù)分化為其他類型的細(xì)胞； 某種成體干細(xì)胞與特定組織來(lái)源的干細(xì)胞發(fā)生融合，產(chǎn)生具有兩種細(xì)胞的遺傳物質(zhì)且染色體數(shù)量也是正常細(xì)胞兩倍的“雜交細(xì)胞”，因而獲得了后者的分化潛能。 4、分化細(xì)胞的功能 檢測(cè)終末分化細(xì)胞的特定蛋白或標(biāo)志物的表達(dá)，很少檢測(cè)終末分化細(xì)胞的功能，有些不同類型的細(xì)胞卻具有相同的標(biāo)志。 檢測(cè)到某種標(biāo)志就證明該細(xì)胞或組織具有正常功能持有質(zhì)疑，特別是干細(xì)胞的異質(zhì)性和類型以及環(huán)境的復(fù)雜性使得人們對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞移植入體內(nèi)能否發(fā)揮預(yù)期功能表示懷疑。