胃腸腫瘤基因檢測(cè)

1、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科肖萍胃腸腫瘤的分子檢測(cè)與診斷胃癌與HER2檢測(cè)結(jié)直腸癌與EGFR、KRAS檢測(cè)胃腸間質(zhì)瘤與C-KIT檢測(cè)內(nèi)容提要胃癌與HER2檢測(cè)胃癌概述胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全世界惡性腫瘤的病死率中胃癌居第二位年齡：40-60歲；性別：男女比例約為3:1臨床表現(xiàn)：癥狀：上腹隱痛、腹脹、食欲不振、惡心嘔吐、嘔血與黑便、貧血、體重下降體征：上腹部深壓痛、腫塊、左鎖骨上淋巴結(jié)腫大胃癌病理表現(xiàn)早期胃癌概念：局限于粘膜或粘膜下層，不論其有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肉眼分型：表淺型、隆起型、凹陷型進(jìn)展期胃癌概念：癌組織浸潤(rùn)到粘膜下層以下者肉眼分型：隆起型、潰瘍型、浸潤(rùn)型組織學(xué)類型:腺癌(管狀-、乳

2、頭狀-、粘液-等)胃癌治療手術(shù)治療仍然是根治胃癌的最有效方法，然而，僅有30-40患者可能通過(guò)單純的手術(shù)治療而獲得治愈大部分患者死于腫瘤的再發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移尋求手術(shù)以外的途徑治療胃癌、預(yù)防其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移成為胃癌綜合治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)晚期胃癌急需有效的治療措施研究顯示HER2陽(yáng)性胃癌患者使用靶向藥物赫賽汀有效HER：human epidermal growth factor receptor，人類表皮生長(zhǎng)因子受體HER2，又名c-erbB-2；原癌基因，位于17q21，編碼跨膜糖蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性；通過(guò)參與信號(hào)傳道通路的一系列活動(dòng)影響細(xì)胞的增殖與分化。HER2信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核細(xì)胞核接合部酪氨酸激

3、酶活性部分細(xì)胞漿細(xì)胞膜生長(zhǎng)因子（配體）促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖 HER2 受體跨膜二聚體的信號(hào)傳導(dǎo)途徑1 = 基因拷貝數(shù)2 = mRNA 轉(zhuǎn)錄3 = 細(xì)胞表面受體蛋白表達(dá)4 = 細(xì)胞外受體功能域釋放A = HER2 DNAB = HER2 mRNAC = HER2 receptor protein正常擴(kuò)增/過(guò)度表達(dá)細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞膜1234CBAHER2過(guò)度表達(dá)：正常狀態(tài)的10-100倍 HER2基因的致瘤機(jī)制：抑制凋亡，促進(jìn)增殖；增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；促進(jìn)腫瘤血管新生和淋巴管新生。 研究表明： 30以上的人類腫瘤中存在HER2基因的擴(kuò)增/ 過(guò)度表達(dá)（如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜 癌、輸卵管癌、胃癌和

4、前列腺癌等HER2在胃癌中表現(xiàn)大約16% 的進(jìn)展期胃癌患者 HER2檢測(cè)呈陽(yáng)性胃癌組織的HER2過(guò)表達(dá)與腫瘤侵犯程度高和預(yù)后差密切相關(guān)；因此對(duì)于胃癌病人都要檢測(cè)HER2赫賽汀是一種針對(duì)HER2陽(yáng)性的胃癌患者新的靶向藥物。準(zhǔn)確的HER2 檢測(cè)對(duì)判斷胃癌患者接受赫賽汀治療是否有效至關(guān)重要關(guān)鍵步驟包括標(biāo)本收集固定石蠟包埋切片脫蠟IHC / FISH 檢測(cè)胃癌HER2 檢測(cè)流程0FISH+可接受赫賽汀治療評(píng)分系統(tǒng)基于: Hofmann M, et al. Histopathology 2008; 52:797805.胃癌HER2 檢測(cè)流程1+2+3+免疫組化腫瘤標(biāo)本標(biāo)本收集標(biāo)本來(lái)源：手術(shù)或活檢標(biāo)本可用

5、于HER2檢測(cè)標(biāo)本初步處理立即 (2030分鐘內(nèi))進(jìn)行標(biāo)本標(biāo)記、切開、固定避開出血和壞死組織標(biāo)本固定標(biāo)本固定不合格是HER2檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤最常見的原因在最快的時(shí)間內(nèi)固定標(biāo)本(20分鐘內(nèi))固定時(shí)間手術(shù)標(biāo)本: 648 h (至少 1 h/mm組織)活檢標(biāo)本: 不長(zhǎng)于 24 h (至少 1 h/mm組織)固定液種類10% 中性福爾馬林新配制的福爾馬林 (定期更新)其他試劑必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，以保證結(jié)果可靠非福爾馬林制劑可能會(huì)妨礙IHC和FISH檢測(cè)的可靠性石蠟包埋標(biāo)本用梯度乙醇/二甲苯脫水，石蠟包埋避免標(biāo)本長(zhǎng)時(shí)間置于融化的石蠟中，因?yàn)楦邷貢?huì)減少抗原表位切片前，石蠟包埋標(biāo)本可長(zhǎng)期存放用新鮮的石蠟石蠟包埋標(biāo)本最

6、小 1 cm2以利于切片切片和脫蠟切片理想的切片應(yīng)該在進(jìn)行HER2檢測(cè)前的短時(shí)間內(nèi)立即進(jìn)行 切片應(yīng)該在腫瘤最有代表性的部位進(jìn)行，且應(yīng)該有HE染色證實(shí)切片厚度可能影響結(jié)果的解讀，保證切片厚度為24 m將切片置于玻片上，放置于室溫下 1224 h 或 60C 1 h 干燥脫蠟標(biāo)本用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化確保脫蠟完全，殘余石蠟會(huì)增加非特異性染色概念：用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片標(biāo)本中某種化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織原位定性、定位或定量研究?；驹砜乖贵w反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量

7、的檢測(cè) 免疫組化技術(shù)免疫組化步驟對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理抗原修復(fù)：微波修復(fù)、熱修復(fù)等阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：H2O2去離子水滴加一抗滴加二抗應(yīng)用DAB溶液顯色、封片結(jié)果觀察胃腺癌HER2檢測(cè)可見不完全細(xì)胞膜染色I(xiàn)HC 陰性 (0)不染色或 10% 的細(xì)胞膜淡染/勉強(qiáng)可見染色；或僅有部分膜染色I(xiàn)HC 可疑 (2+)10%的細(xì)胞輕到中度完整細(xì)胞膜或基側(cè)細(xì)胞膜染色 IHC 陽(yáng)性 (3+)完整細(xì)胞膜或基側(cè)細(xì)胞膜強(qiáng)染色，且具有如下兩種情況之一切除標(biāo)本中，染色細(xì)胞比例10% 活檢標(biāo)本中，不管染色細(xì)胞比例多少(如10%)，具有聚集的強(qiáng)染色細(xì)胞克隆胃癌的HER2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)FISH技術(shù)介紹-樣本預(yù)處理探針、樣本變性探

8、針樣本雜交雜交后洗滌結(jié)果觀察五步完成實(shí)驗(yàn)操作觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置及數(shù)量可反映相應(yīng)染色體的情況腸型印戒細(xì)胞型高度擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增胃癌組織中Her2表達(dá)具異質(zhì)性 FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)單 檢測(cè)快速 結(jié)果易觀察靈敏性和特異性高，結(jié)果可靠、重復(fù)性好可檢測(cè)樣本種類多 空間定位精確結(jié)直腸癌與EGFR 、KRAS檢測(cè)定義：發(fā)生于結(jié)直腸粘膜上皮的惡性腫瘤流行病學(xué)：地域性：不同地區(qū)發(fā)病率有明顯區(qū)別 高發(fā)：北美、西歐、澳洲等；低發(fā)：日本、南美、非洲等年齡：國(guó)內(nèi)以4050歲為多，中位數(shù)為45左右，40歲以下者全部病例的1/3左右；高發(fā)國(guó)家大腸癌高發(fā)年齡為6070歲好發(fā)部位：直腸、乙狀結(jié)腸病理分型：同胃癌結(jié)直腸癌

9、概況EGFR與KRAS表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR），表達(dá)于正常上皮細(xì)胞表面，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的作用，EGFR的過(guò)表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、預(yù)后差有關(guān)。EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：Ras/ Raf/ MEK/ERK-MAPK 通路PI3K/Akt/mTOR通路KRAS蛋白處于EGFR信號(hào)通路的下游。在正常生理情況下，EGFR信號(hào)通路被活化后，KRAS蛋白短暫激活，其后迅速失活，KRAS激活/失活效應(yīng)是受控的。而KRAS基因突變時(shí)，可以導(dǎo)致EGRF信號(hào)通路持續(xù)激活，加速腫瘤細(xì)胞增殖。Schubb

10、ert S et al., Nat Rev Cancer 2007; 295-308EGFR與KRASSchubbert S et al., Nat Rev Cancer 2007; 295-308EGFR與KRASK-ras是EGFR通路下游重要的效應(yīng)子。EGFR靶向治療和K-ras突變相對(duì)立K-ras突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益，反而徒增不良反應(yīng)危險(xiǎn)和治療費(fèi)K-ras野生型患者才有可能從這類藥物治療中獲益在結(jié)直腸癌中，K-ras基因突變率為35%-45%，已成為EGFR單克隆抗體治療結(jié)直腸癌的主要療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物。NCCN指南明確指出所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)K-ras基因狀態(tài)

11、。提高腫瘤臨床治療的針對(duì)性，降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的治療時(shí)間。 美國(guó)ASCO 推薦把K-ras 12、13號(hào)密碼子突變檢測(cè)作為結(jié)直腸癌患者接受EGFR單抗治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)。EGFR、KRAS與結(jié)直腸癌K-RAS突變檢測(cè)適用范圍結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸癌、非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)意義輔助臨床醫(yī)生篩選出可受益于愛(ài)必妥（Erbitux，西妥昔單抗）和帕尼單抗（Panitumumab）等靶向藥物的癌癥患者。僅適用于無(wú)突變的K-RAS基因野生型患者，對(duì)K-RAS突變患者無(wú)效。為患者個(gè)性化用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低治療風(fēng)險(xiǎn)以及患者負(fù)擔(dān)。檢測(cè)方法：PCR基本原理： 利用PCR法擴(kuò)增目的基因片段進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)樣本： 腫瘤

12、組織或其石蠟病理切片提取的DNAK-RAS突變檢測(cè)K-RAS突變檢測(cè)K-RAS基因最常見的激活方式為點(diǎn)突變 集中在12、13密碼子突變，且與臨床、治療及預(yù)后是密切相關(guān)。其它的密碼子是沒(méi)有意義的胃腸間質(zhì)瘤與C-kit檢測(cè)胃腸間質(zhì)瘤（Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST）胃腸間質(zhì)瘤是一類特殊的、胃腸道最常見的間葉源性腫瘤。1998年之前一直被診斷為消化道平滑?。ㄈ猓┝龌颍◥盒裕┥窠?jīng)鞘瘤。1998年之后，GIST的分子研究獲得重大突破，發(fā)現(xiàn)大部分GIST表達(dá)c-kit基因蛋白產(chǎn)物CD117，c-kit基因獲得有功能性突變，這是GIST的特征性表現(xiàn)。定義：原發(fā)于消化道

13、，由突變的c-kit或PDGFRA基因驅(qū)動(dòng)、表達(dá)c-kit 蛋白（CD117），組織學(xué)上由梭形細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、偶或多形性細(xì)胞構(gòu)成的間葉源性腫瘤。GIST：發(fā)病機(jī)制基因突變?cè)诖蠖鄶?shù)病例的惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要 作用C-kit ：7085%PDGFRA：58%約8-15%的病例未檢測(cè)到KIT/PDGFRA突變 （“野生型GIST”）GIST發(fā)病過(guò)程正常的C-KIT基因發(fā)生突變轉(zhuǎn)錄、翻譯CD117異常增多調(diào)節(jié)并刺激細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)KIT基因激活是GIST致病原因c-kit基因：原癌基因，編碼產(chǎn)物（CD117）定位于細(xì)胞膜臨床表現(xiàn)常常為無(wú)癥狀，偶然被發(fā)現(xiàn) 癥狀/體征與腫瘤的位置和大小有關(guān)腹部腫塊 (

14、38%)，胃腸道出血 (30%), 腹部隱痛或不適(40%)貧血、食欲減退，體重減輕，惡心，乏力急性腹膜內(nèi)出血或穿孔梭形細(xì)胞型上皮樣細(xì)胞型混合型病理表現(xiàn)組織學(xué)表現(xiàn)組織學(xué)上GIST由梭形細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、偶或多形性細(xì)胞組成病理學(xué)表現(xiàn)免疫組化GIST特征性表達(dá)CD117（ 90-95%）、 DOG1（98%）DOG1（Discovered on GIST-1）是最近發(fā)現(xiàn)的一種在GIST中特異表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白，由DOG1基因編碼，是一種功能尚不明確的蛋白 大多數(shù)表達(dá)CD34（70%）；局灶性表達(dá)SMA（40%）和S-100蛋白（5%）；通常不表達(dá)Desmin（2%）；Ki-67表達(dá)反映增殖指數(shù)。 C

15、D117DOG1 GIST的病理診斷依據(jù)GIST的病理診斷必須依據(jù)組織學(xué)特點(diǎn)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果做出。免疫組化：CD117（陽(yáng)性率95）、 DOG1（98%） 、CD34（陽(yáng)性率70）、SMA（陽(yáng)性率40）、S-100（陽(yáng)性率5）和desmin（陽(yáng)性率2）對(duì)GIST的輔助診斷十分有用。組織學(xué)符合典型GIST、CD117或DOG1陽(yáng)性的病例可做出GIST的診斷。組織學(xué)表現(xiàn)符合典型GIST,CD117、 DOG-1陰性病例重新免疫組化檢測(cè)CD117 和DOG-1蛋白。交由專業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)C-kit或PDGFRA基因的突變。C-kit或PDGFRA基因檢測(cè)到有意義的突變，則可診斷為GIST

16、。檢測(cè)基因突變的位點(diǎn)：6個(gè)C-kit基因第9、11、13和17號(hào)外顯子PDGFRA基因第12和18號(hào)外顯子由于大多數(shù)GIST（70%-85%）的基因突變發(fā)生在C-kit基因第11號(hào)外顯子或第9號(hào)外顯子，因此可優(yōu)先檢測(cè)這兩個(gè)外顯子。組織學(xué)表現(xiàn)符合典型GIST，CD117、DOG-1陰性，且無(wú)基因突變的病例的處理在排除胃腸道可能發(fā)生的其他腫瘤（如平滑肌腫瘤、神經(jīng)源性腫瘤等）后也可做出GIST（野生型）的診斷。標(biāo)本處理手術(shù)后標(biāo)本的固定: 所有的標(biāo)本應(yīng)該在離體后盡快的進(jìn)行相應(yīng)的保存和固定固定的意義：使蛋白質(zhì)、核酸等大分子在原位凝固沉淀使細(xì)胞內(nèi)各種酶滅活，防止細(xì)胞自溶保證免疫組織化學(xué)及分子學(xué)檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性所有的組織學(xué)標(biāo)本建議用10%的中性福爾馬林固定，應(yīng)該避免使用酸性的福爾馬林或是Bouin液固定影響免疫組化和基因檢測(cè)的原因免疫組化推薦Envision兩步法：抗體CD117、DOG1：Dako抗原修復(fù)：1：400 檸檬酸緩沖液（pH6.0）熱修復(fù) 免疫組化對(duì)象對(duì)診斷疑難病例（組織學(xué)符合GIST，但CD117、DOG1 陰性）推薦對(duì)所有高危性、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)性GISTs進(jìn)行突變分析家族性GIST，兒童GIST， NF1（1型神經(jīng)纖維瘤病）意義明確診斷指導(dǎo)治療基因檢測(cè)方法PCR擴(kuò)增-直接測(cè)序基因檢測(cè)應(yīng)該在有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)優(yōu)先檢測(cè)最常見的突變位點(diǎn) C-kit 11、9、13、17；P