第六章原核生物基因表達的調(diào)控

1、6 原核生物(shngw)基因表達的調(diào)控6.1 乳糖操縱元 lactose operon6.2 色氨酸操縱元6.3 基因轉(zhuǎn)錄的時序調(diào)控6.4 小分子(fnz)RNA的翻譯調(diào)節(jié)6.5 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控共七十一頁6.1.1 Discovery of Operon 1961年, F. Jacob & J.Monod提出, 此后不斷完善。獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎1940年， Monod發(fā)現(xiàn)：細菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。文獻：細胞中存在兩種酶，即組成酶與誘導(dǎo)酶1947年，報告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)

2、象(xinxing)及其在細胞分化中的意義”Francis Jacob Jacques Monod 6.1 乳糖(r tn)操縱元共七十一頁1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細胞對誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當阻遏物存在時，酶無法合成，只有(zhyu)有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。 Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達。共七十一頁乙?；D(zhuǎn)移酶半乳糖苷透性酶-半乳糖苷酶操作位點乳糖(r tn)操縱元結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)(tioji)基因共七十一頁操縱元是一種完整

3、的具有特定功能的細菌基因表達和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，操縱位點，結(jié)構(gòu)基因，組成一個控制(kngzh)單元結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)操縱位點 promotor,operator：啟動子結(jié)合位點調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點結(jié)合） 結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄 誘導(dǎo)物存在時，可與阻遏蛋白結(jié)合 結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄Control elementStructural genes共七十一頁6.1.2 酶的誘導(dǎo)(yudo)現(xiàn)象B-半乳糖苷酶共七十一頁分解底物的酶只有在底物存在(cnzi)時才出現(xiàn)！無乳糖時，幾個(j )B-gal/cell 加入乳糖時，5000個 再去掉乳糖，lac mRNA下降 乳糖能激發(fā)lac

4、 mRNA的合成 乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？ 培養(yǎng)基（35S-aa, 無乳糖） E.coli繁殖 培養(yǎng)基（無35S -aa, 加入乳糖） -gal(無35S)共七十一頁6.1.3 調(diào)控(dio kn)機理1 調(diào)控(dio kn)區(qū)結(jié)構(gòu) lacI, 1045bp，獨立PiP, 82bp，821O, 35bp，728lacZYA共七十一頁2. 阻遏(z )狀態(tài)共七十一頁3 誘導(dǎo)(yudo)狀態(tài)誘導(dǎo)(yudo)物誘導(dǎo)作用：在可誘導(dǎo)的操縱元中，加入對基因表達有調(diào)節(jié)作用的小分子后，開啟基因的轉(zhuǎn)錄活性共七十一頁4 誘導(dǎo)物不是(b shi)乳糖生成(shn chn)lac誘導(dǎo)物乳糖

5、代謝Allolctose 異構(gòu)乳糖 別乳糖細胞內(nèi)-半乳糖苷酶來源?共七十一頁6.1.4 阻遏蛋白(dnbi)的作用機制1 阻遏(z )蛋白結(jié)構(gòu)38KD，4 聚體，一個亞基結(jié)合一個乳糖分子lacI 組成型轉(zhuǎn)錄 Pi 弱啟動子， 510個cell具有二重性 阻止轉(zhuǎn)錄（與lacO結(jié)合） 開始轉(zhuǎn)錄（與誘導(dǎo)物結(jié)合）共七十一頁 阻遏(z )蛋白的結(jié)構(gòu)域 頭段，-NH2端，lacO結(jié)合(jih)區(qū) 絞鏈區(qū) 核心段，-COOH， 誘導(dǎo)物結(jié)合區(qū)共七十一頁4個亞基的核心片段(pin dun)接觸形成四聚體共七十一頁共七十一頁 對稱軸，+11 對稱(duchn)序列，6bp 阻遏(z )蛋白的結(jié)合位點lacO的結(jié)構(gòu)

6、共七十一頁3 阻遏蛋白對RNA pol功能(gngnng)的影響阻遏蛋白(dnbi)和RNA pol可同時與DNA結(jié)合 RNA pol 與啟動子結(jié)合的平衡常數(shù) 1.9X107 有阻遏蛋白時, 2.5X109結(jié)合著的RNA pol不能轉(zhuǎn)錄. 但加入誘導(dǎo)物后, 釋放出阻遏蛋白, 變?yōu)殚_放型啟動子復(fù)合物.阻遏蛋白實際上使RNA pol貯存在啟動子上。這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中？共七十一頁+ glucose- glucoseTime (hr)Units of -galactosidase+ lactoseGlucose added6.1.5 lac operon的正調(diào)控1 代謝物阻遏(z )效

7、應(yīng)實驗，在lacGlu培養(yǎng)基上 E.coli只利用G，只有G 耗盡(ho jn)時，才會利用lac葡萄糖抑制lac mRNA的轉(zhuǎn)錄： 可阻止誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng) 僅去掉阻遏物并不能啟動lac基因表達,有其它因素參與共七十一頁葡萄糖對lac操縱元表達的抑制是間接的 乳糖的降解是通過(tnggu)cAMP與 CAP結(jié)合起作用的 cAMP:環(huán)化腺苷酸CAP, catabolite activator protein 由crp編碼(bin m)CRP, catabolite receptor protein共七十一頁共七十一頁2 CAP結(jié)合(jih)位點CAP為二聚體， 45KD ，被cAMP激

8、活(j hu)結(jié)合位點22bp I -70 -50 II -50 -40共七十一頁由于(yuy)序列的差異，使不同基因受cAMP激活的水平不同結(jié)合(jih)位點序列保守共七十一頁 3 CAP的結(jié)合(jih)對DNA構(gòu)型的影響DNA彎曲彎曲點位于CAP結(jié)合(jih)位點二重對稱的中心彎曲使CAP能與啟動子上的RNA pol 接觸共七十一頁（1）CAP結(jié)合位點與轉(zhuǎn)錄起始點的位置CAP與轉(zhuǎn)錄起始點的距離(jl)，相距數(shù)個整雙螺旋CAP結(jié)合位點在啟動子的上下游，都能發(fā)揮作用4 CAP對轉(zhuǎn)錄(zhun l)的影響共七十一頁（2）基因轉(zhuǎn)錄(zhun l)對cAMPCAP系統(tǒng)的依賴性， 與啟動子本身的效率有

9、關(guān)cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合(jih)，使位點II附近的富含GC區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，因而-10區(qū)的熔解溫度降低，促進開放型啟動子復(fù)合物的形成共七十一頁（3） CAP激活(j hu)轉(zhuǎn)錄的方式CAP直接作用于RNA pol a亞基 缺失RNA pol a亞基的C末端(m dun)時，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改變其結(jié)構(gòu)共七十一頁6.1.6 lac operon 的其它(qt)問題1. lac operon的功能是在正負兩個調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinate regulation)下實現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP不發(fā)揮作用；如沒有CAP加強轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從P上解聚仍

10、無轉(zhuǎn)錄活性CAP組成型合成，所以cAMPCAP復(fù)合物取決于cAMP含量腺苷酸環(huán)化酶位于細胞膜上，其活性與葡萄糖運輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMPCAP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖類代謝有關(guān)的酶降解物敏感型操縱元：只要有葡萄糖存在，這些(zhxi)操縱元就不表達 共七十一頁2. A基因及其生理功能 編碼B-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶，使半乳糖苷乙酰化。該酶不參與乳糖代謝！ 生理意義：在細胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質(zhì)，其分解產(chǎn)物不能進一步代謝，積累，抑制細胞生長(shngzhng)。半乳糖苷乙?；?，即無毒. 所以lacA雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質(zhì)的積累3. lac基因產(chǎn)物數(shù)量，

11、 1：0.5：0.2 不同酶的數(shù)量差異,是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié). 方式有二:核糖體脫離: 多順反子的差別性翻譯 內(nèi)切酶作用: 在lac mRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用共七十一頁Summary共七十一頁共七十一頁Summary of lac operon regulationGlucosecAMPLactoseTranscription of lac mRNAHighLowPresentlow rate of expressionHighLowAbsentessentially noneLowHighAbsentessentially noneLowHighPresenthi

12、gh rate of expression共七十一頁6.2 Trp operon生物細胞中的氨基酸合成(hchng)， 也受操縱元的調(diào)節(jié)。細胞需要某種氨基酸時，其基因即表達，不需要時基因關(guān)閉，達到經(jīng)濟的原則。共七十一頁trpR, 阻遏蛋白P，-40+18 O, -21+1L, +1+162結(jié)構(gòu)(jigu)基因t, A下游(xiyu)36bp, 不依賴p t, t下游250bp，依賴p 6.2.1 基因組成共七十一頁sne298共七十一頁6.2.2 Trp operon 的阻遏(z )系統(tǒng)1 Trp R 四聚體共七十一頁阻遏(z )蛋白trp 有活性的阻遏物SNE299trp O 不轉(zhuǎn)錄(zhu

13、n l)共七十一頁2 阻遏蛋白的結(jié)合(jih)位點 trpO -21 +1，反向重復(fù)序列trpP -40 +18活性阻遏物與trpO 的結(jié)合與RNA pol與啟動子的結(jié)合發(fā)生競爭SNE299共七十一頁3 阻遏(z )系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄(zhun l)是否啟動，在培養(yǎng)基中有少量Trp時， mRNA起始合成，但不能自動延伸，一般在trpE之前終止轉(zhuǎn)錄 粗調(diào)開關(guān)共七十一頁6.2.3 弱化(ru hu)作用 attenuation1 弱化(ru hu)子，衰減子，前導(dǎo)RNA，140bp共七十一頁弱化(ru hu)子，衰減子，共七十一頁序列(xli)分析發(fā)現(xiàn)，其中4個片段進行配對，形成不同的二級結(jié)構(gòu)Termi

14、nator共七十一頁S3122 前導(dǎo)(qindo)肽14aa共七十一頁共七十一頁3 轉(zhuǎn)錄弱化(ru hu)作用Lack of trp Lack of aminoacyl tRNA Ribosome pause at trp codons , occluding sequence 1Form 2:3 hairpin anti-terminator Transcription into trpE and beyond 共七十一頁High trp Trp is inserted at the trp codons Translate to the end of leader message Ribo

15、some occlude sequence 2Terminate transcription at (3:4 form terminator)共七十一頁弱化子對轉(zhuǎn)錄調(diào)控(dio kn)的關(guān)鍵空間結(jié)構(gòu)，10th and 11th codons encode trp residues (rare AA)時間，核糖體停頓在2個Trp 密碼子上時，產(chǎn)生(chnshng)延宕， 此時4區(qū)未轉(zhuǎn)錄出來The leader peptide is to determiner trp availability and to regulate transcription termination14amino-aci

16、d (encoded by 27-68 of the leader RNA summary共七十一頁6.2.4 阻遏(z )作用與弱化作用的協(xié)調(diào) 阻遏效率 啟動子的轉(zhuǎn)錄起始頻率在R+和R-相差70倍 弱化(ru hu)作用 trp存在時，約有10的RNA pol僥幸轉(zhuǎn)錄trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系？共七十一頁Negativerepressible operon可以被最終合成(hchng)產(chǎn)物所阻遏R P O leading seq. E D C B Atrp+為什么需要阻遏體系？ 當大量Trp 存在時，阻遏系統(tǒng)(xtng)起作用。阻遏物與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。 經(jīng)濟共七十一頁僅有少量

17、trp時，RNApol啟動(qdng)，但在L.S.處脫落，轉(zhuǎn)錄中斷R P O leading seq. E D C B A少量trp+不足以結(jié)合(jih) O 位點為什么需要弱化系統(tǒng)？ 當trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp 合成。因此需要一個能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當?shù)腡rp水平,弱化系統(tǒng)恰恰符合此要求。共七十一頁共七十一頁6.2.5 正控制系統(tǒng)(kn zh x tn)和負控制系統(tǒng)(kn zh x tn)1 負控制系統(tǒng)： 在沒有(mi yu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因表達，加入調(diào)節(jié)蛋白后基因表達活性被關(guān)閉 阻遏蛋白：負控制系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白共七十一頁

18、Add signal mol. Operon offCo-repressor 輔阻遏物Add signal mol. Operon onInducer 誘導(dǎo)物(inducible operon)(repressible operon)負控誘導(dǎo)(yudo)負控阻遏(z )共七十一頁2 正控制系統(tǒng)(kn zh x tn)：沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因關(guān)閉,加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性被開啟誘導(dǎo)(yudo)蛋白共七十一頁6.3 基因轉(zhuǎn)錄(zhun l)的時序調(diào)控概念：原核生物在生長發(fā)育的各個階段，基因的表達是按照一定時間順序進行的意義 有效利用能源 避免不適當(shdng)的表達，造成的危害途徑 亞基的

19、更換（枯草桿菌，E.coli，T4 phage） T7噬菌體生長過程中RNA pol的替代 噬菌體基因表達的調(diào)控共七十一頁亞基的更換(gnhun)8.3.1枯草桿菌噬菌體SPO1早中晚基因表達(biod)的轉(zhuǎn)換SPO1，烈性噬菌體如何實現(xiàn)早中晚基因表達的轉(zhuǎn)換?通過更換亞基，使SPO1的早中晚基因有條不紊地表達因子的負責(zé)識別啟動子的保守序列，是轉(zhuǎn)錄起始唯一需要的因子。許多細菌能生產(chǎn)多種可取代的因子，以識別不同的啟動子。當細胞從基本的轉(zhuǎn)錄機制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合共七十一頁早期(zoq)，2 55，產(chǎn)生gp28gp28 取代(qdi) 55共七十一頁

20、中期， gp28 取代(qdi) 55產(chǎn)生gp33, gp34共七十一頁晚期(wnq),gp33, gp34取代 gp28， 55共七十一頁枯草桿菌中每個因子都能識別具有特征性的一致(yzh)序列的一組啟動子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互取代的原因，可能是它們與核心(hxn)酶的親和力所決定的共七十一頁6.4 小分子(fnz)RNA的翻譯調(diào)節(jié)6.4.1 干擾mRNA的互補RNA mRNAinterfering complementary RNA1983年，Mizuno, Simon幾乎同時(tngsh)發(fā)現(xiàn)RNA可作為調(diào)節(jié)因子， 與調(diào)節(jié)蛋白一樣，RNA合成后，可擴散到靶位點。 RNA也可作為調(diào)節(jié)物質(zhì) ？！反義

21、RNA，可與mRNA結(jié)合 結(jié)合位點是S-D, AUG, 部分N端密碼子 與RNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，作為內(nèi)切酶底物 與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄提前終止共七十一頁例，E coli 中外膜蛋白 ompF 的 表達調(diào)控噬菌體，cII蛋白抑制(yzh)晚期基因轉(zhuǎn)錄Tn10中轉(zhuǎn)座酶翻譯的調(diào)節(jié)共七十一頁6.4.2 E coli 中 ompF 基因(jyn)的翻譯調(diào)節(jié)Env，編碼(bin m)滲透壓感受器的受體蛋白ompC低滲時，ompC關(guān)閉，ompF增加高滲時，ompC增加，ompF下降ompC與ompF是外膜蛋白，受培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)共七十一頁共七十一頁RNAi 技術(shù)(jsh) 1998年2月，Andrew F

22、ire等將單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效(o xio)特異性阻斷相應(yīng)基因的表達。將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾1984年，抗病毒藥物的開發(fā)1988年, 轉(zhuǎn)基因番茄（PG 酶的反義RNA）共七十一頁延緩(ynhun)成熟的轉(zhuǎn)基因西紅柿ACC， 1-氨基丙環(huán)烷羧酸(su sun)氧化酶， 乙烯合成途徑酶類 PG，半乳糖醛酸酶第一個上市的轉(zhuǎn)基因植物共七十一頁6.5 轉(zhuǎn)錄(zhun l)后調(diào)控翻譯起始的調(diào)控(dio kn)mRNA的核糖體結(jié)合位點中有SD序列，其與核糖體16sRNA的端互補配對，有利于翻譯的起始.RBS的結(jié)合強度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與其始密碼